【关键词】 胰蛋白酶
关键词: 胰蛋白酶;细胞培养;角蛋白细胞
1 材料和方法
1.1 材料 ①KC的培养:无菌条件下手术取人包皮，尽量剪除皮下组织，置于1.5g・L-1 Dispase液中4℃18～24h.将真表皮分离，取表皮分别置于2.5g・L-1 胰蛋白酶0.1g・L-1 二乙胺四乙酸二钠（EDTA）及含100mL・L-1 血清的DMEM中吹打成单细胞悬液，离心300g・min-1 ，10min，弃悬液，KC无血清培养基（GibcoBRL）重悬细胞，调整细胞数至1×103 ・L-1 ，接种至6孔培养板，24h后换液.当细胞生长至80%～90%汇合时1∶2传代.
1.2 方法 ①分组:KC传代时分为两组，预处理组:细胞约80%汇合时，加入2.5g・L-1 胰蛋白酶0.1g・L-1 EDTA，当胞体开始回缩时吸除胰酶，终止消化，此时，基本上无细胞脱落.继续培养12～18h，2.5g・L-1 胰蛋白酶0.1g・L-1 ED-TA消化，KC胞体回缩变圆，细胞接近脱离瓶（皿）壁时终止消化，1∶2传代.对照组:当KC80%～90%汇合时2.5g・L-1 胰蛋白酶0.1g・L-1 EDTA消化，至KC胞体回缩变圆，细胞接近脱离瓶壁时终止消化，1∶2传代;②计算细胞贴壁率:首次传代接种后3，6，16和24h分别记数200个细胞，计算平均细胞贴壁率;③吖啶橙和溴化乙锭染色:在第6，8，10代传代接种前取细胞悬液10μL加吖啶橙和溴化乙锭混合物10μL，轻轻摇匀置室温5min，荧光显微镜下记数200个细胞，观察细胞受损情况，计算活细胞比率;④按文献方法计算细胞倍增次数，绘制细胞生长曲线［1］ .
统计学方法:贴壁率和活细胞比率的比较用χ2 检验.
2 结果
首次传代的KC胰蛋白酶预处理组在接种后1h即有部分细胞贴壁，至6h细胞70%贴壁，24h贴壁率为95%，而对照组KC约3h开始贴壁，24h贴壁率为70%.预处理组，KC贴壁早且贴壁率明显高于对照组（P&<0.01）.吖啶橙和溴化乙锭染色比较传代中两组细胞活细胞数:预处理组第2，4，6代传代中活细胞数分别为91%，90%，89%，明显高于对照组（60%，59%，62%）（P&<0.01）.两组细胞生长曲线比较:胰蛋白酶预处理组细胞传至第10～12代仍保持增殖状态，增殖时间明显比未处理组长.未处理组从第6代开始，细胞生长速度有所减慢，仍能长满瓶底，传代细胞虽能贴壁，但生长速度明显减慢，第8代开始细胞逐渐相连成片，覆盖整个瓶底，细胞仍然存活，但此时传代细胞很难存活，呈生长停滞状态. 转贴于 3 讨论
原代培养的KC生长分为3期［2］ ，延缓期、增殖期和停滞期.首次传代一般在KC增殖早期，此时细胞刚刚度过延缓期，脆弱易损，首次传代对于KC是否能长期存活尤为重要.而在KC增殖后期，细胞贴壁紧密，消化时间不足，细胞不易从瓶壁脱落，不仅传代细胞数量少，影响实验的准确性，而且由于局部代谢物的积累，细胞即进入停滞期，若消化时间过长，待细胞完全从瓶壁脱落，则细胞膜已受损，死细胞增多.KC难养不仅因为其对培养基要求条件高，而且传代也是KC培养的难点之一.
胰蛋白酶是常用的消化液，可使细胞脱离附着物表面和相互离散成单个细胞，但胰蛋白酶对细胞也有损伤可影响细胞活性.我们采用胰蛋白酶预处理法，能明显提高KC传代质量，首次传代，胰蛋白酶预处理组KC活力好，细胞大部分6h内贴壁，且24h内95%细胞贴壁，传代中两组细胞的吖啶橙和溴化乙锭染色检测也显示，预处理组传代时细胞受损明显少于对照组，这可能是提高KC传代质量的原因［3］ .
参考文献
［1］Rheinwald JG，Green H.Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes:The formation of keratinizing colonies from single cells ［J］.Cell，1975;6（3）:331-344.
［2］Liu SC，Karasek M.Isolation and growth of adult human epi-dermal keratinocytes in cell culture ［J］.J Invest Dermatol，1978;71（2）:157-162.
［3］Norris DA，Kissinger RM，Naughton GM et al.Evidence for immunologic mechanisms in human vitiligo:Patient’s sera com-plement-mediated damage and antibody-dependent cellular cyto-toxicity ［J］.J Invest Dermatol，1998;90（6）:783-789.