【关键词】 卵巢肿瘤
关键词: 卵巢肿瘤;细胞系;端粒酶;逆转录酶抑制剂
摘 要:目的 研究逆转录酶抑制剂（AZT）对卵巢肿瘤细胞端粒酶活性的影响. 方法 采用TRAP-ELISA方法检测卵巢癌HO-8910细胞在AZT作用前后端粒酶活性的变化，以流式细胞仪分析细胞周期的改变. 结果 AZT作用后的HO-8910细胞端粒酶活性明显受抑制，且细胞的G2 /M期DNA含量明显增高. 结论 AZT能明显抑制肿瘤细胞的端粒酶活性.
Keywords:ovarian neoplasms;cell line;telomerase;reverse transcriptase inhibitor
Abstract:AIM To study the effect of inhibition of telom-erase activity by reverse transcriptase inhibitors（AZT）on o-varian cancer cells in vitro.METHODS Telomerase activity was determined by TRAP-ELISA in untreated and treated HO-8910cells by AZT，cell cycle phases were analyzed by flow-cytometry.RESULTS Telomerase activity of HO-8910cells was significantly inhibited when treated with AZT，and cell cycle of treated HO-8910cells was changed with marked increase in G2 /M phase.CONCLUSION AZT can effective-ly inhibit telomerase activity of tumor cells，and represent an effective and novel approach for treatment of cancer.
0 引言
端粒酶是一种特殊的逆转录酶，以端粒末端富含鸟嘌呤单链为引物，自身RNA为模板，不断合成端粒重复片段序列添加至染色体的末端，维持染色体的稳定性［1］ .近年来大量研究表明，人类85%以上的恶性肿瘤都有端粒酶活性表达，而正常体细胞及良性肿瘤中端粒酶活性表达极低或无表达［2］ .在卵巢癌细胞中端粒酶活性普遍呈高表达，提示端粒酶激活可能是肿瘤增殖的决定性因素［3］ .逆转录酶抑制剂（AZT）是利用核苷类似物和正常单核苷酸竞争与模板RNA结合，阻止反转录过程，达到抑制端粒酶活性和抑制端粒扩充的作用.最终使细胞恶变的过程得到抑制［4］ .我们通过AZT对卵巢癌细胞株HO-8910细胞的作用，探讨其对端粒酶活性的影响，为卵巢癌及其他肿瘤的靶向治疗尝试新的途径.
1 材料和方法
1.1 细胞株 卵巢癌细胞株HO-8910细胞由本实验室提供.常规培养于含100mL L-1 小牛血清、10×104 u L
-1 青霉素、10×104 u L-1 链霉素的RPMI-1640培养液中.实验选用对数生长期细胞.
1.2 试剂 3’-azido-3’-deoxythymidine（AZT）为Sigma公司产品，Telomerase-PCR-ELISA检测试剂盒为Boehringer Manheim公司产品，小牛血清为浙江四季青公司产品，RPMI-1640为Hyklong公司产品.
1.3 细胞处理及标本制备 HO-8910细胞接种于100mL培养瓶中至对数生长期，加浓度为0.5，0.8，1.0和1.5mol L-1 的AZT作用24，48和72h，空白对照组加等量培养液.分别收集AZT作用不同时间之后的细胞，加PBS500μL，于4℃3000r min-1 离心10min充分移去上清.加裂解液，重新悬浮细胞并在冰上孵育30min，4℃20000g离心25min，吸取上清备用.取未经任何处理的HO-8910细胞65℃热处理10min作阴性对照.
1.4 端粒酶活性测定
1.4.1 RT-PCR扩增 取上述提取液2μL加反应混合物（包括DNTP Taq酶生物素标记的端粒酶引物Ⅰ及引物Ⅱ）并补充灭菌DEPC水，在PCR扩增仪（Perkin Eliner480型）上按以下步骤进行①逆转录:25℃30min;②端粒酶灭活:94℃5min;③PCR扩增:94℃30s，50℃30s，72℃90s，循环30次;④延伸:72℃10min.
1.4.2 扩增产物检测 取5μL扩增产物，加20μL变性试剂，室温孵育10min，加225μL杂交混合液（含地高辛标记的探针）充分混匀，加100μL混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上，37℃摇床杂交2h，弃除微孔板上的杂交液，用洗液充分清洗后，加与过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体，室温孵育30min后弃除抗体，充分清洗.再加100μL TMB显色10～20min，最后加100μL终止液终止反应，酶标仪上测A450nm 值.
1.5 细胞周期分析 将用AZT处理和未处理的HO-8910细胞分别培养72h离心收集，用PBS清洗2次，再用冷乙醇700mL L-1 固定4℃保存.检测前离心去乙醇，碘化丙啶染色15～20min，置流式细胞仪测定细胞周期中不同时相的细胞数. 统计学处理:用EXCEL软件进行组间t检验，计算P值.
2 结果
2.1 端粒酶活性与AZT作用剂量及时间 AZT0.5mol L-1 作用24h后端粒酶活性即出现抑制.随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强，各组间均有显著差异（P&<0.05）.同一浓度药物，随着作用时间的延长，抑制作用也逐渐增强（P&<0.05，Tab1）.
表1 AZT对HO-8910细胞端粒酶活性的影响 略
2.2 细胞周期的分析 用流式细胞仪测定了800 μmol L-1 的AZT作用72h后的HO-8910细胞，G2 /M期细胞数所占百分比为57.7%，对照组为21.5%（Fig1）.
图1 略
3 结论
端粒位于真核细胞线性染色体的末端，对于稳定染色体维持其完整性有重要作用.在细胞周期性分裂过程中，由于DNA聚合酶不能复制线性染色体的最末端.使染色体在细胞复制过程中逐渐缩短.当端粒缩短到一定程度，失去对细胞的保护作用而导致细胞衰老死亡.端粒酶是一种特异性逆转录酶，由端粒酶RNA和蛋白质组成，端粒酶RNA具有模板功能，含有引物识别位点，能以自身RNA组分为模板合成端粒DNA并加到染色体末端，以弥补由于染色体因细胞分裂出现的末端进行性缩短而使细胞无限增殖，导致肿瘤发生和细胞永生化.
AZT属核苷类似物，最早用于治疗AIDS.其可与正常单核苷酸竞争与RNA模板结合使转录链终止，抑制反转录过程及反转录酶的活性，使细胞复制过程受阻生长受到抑制.因此也称之逆转录酶抑制剂.在近几年对肿瘤治疗的体外研究中发现，AZT可抑制多种肿瘤细胞的端粒酶活性，使端粒缩短，影响细胞的增殖及生长［5-7］ .在卵巢癌化疗中，AZT与化疗药顺铂、阿霉素、5-FU等联用使其化疗效应更明显［8］ .本实验显示，AZT具有抑制HO-8910细胞端粒酶活性的作用，而且其作用具有剂量依赖性和时间依赖性.流式细胞仪表明，端粒酶活性被抑制后，HO-8910细胞的增殖出现障碍，主要将细胞阻止在G2/M期，说明细胞周期与端粒酶活性的变化有一定的联系.在细胞调控网络中，有人认为端粒酶与细胞周期有共同的调节因素，肿瘤细胞被阻止在G0 /G1 期时，端粒酶活性无明显变化，细胞被阻止在S期时，端粒酶活性逐渐增高，在G2 /M时，端粒酶活性显著下降［9］ .由于细胞调控网络非常复杂，这些变化与细胞的分化、凋亡的内在联系还有待于进一步研究.
在本实验中AZT能明显抑制HO-8910细胞的增殖和端粒酶活性，可以作为化疗药用于卵巢癌或其他肿瘤，通过抑制正常细胞所不具备的端粒酶活性，增加治疗特异性，避免治疗副作用.由于端粒酶在恶性肿瘤中有特异性的表达，抑制端粒酶活性在肿瘤治疗中具有广谱性，将成为治疗肿瘤一个新的最有希望的方法.端粒酶活性的检测也有望成为判定化疗效率的一个最新标志［7，10］ .
参考文献
［1］Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，Harley CB，West MD，Ho PLC，Coviello GM，Wright WE，Weinrich SL，Shay JW.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer ［J］.Science，1994;266:2011-2015.
［2］Shay JW，Wright WE.Telomerase activity in human cancer［J］.Curr Opin Oncol，1996;8:66-71.
［3］Lundblad V，Wright WE.Telomerase:A simple picture be-comes complex ［J］.Cell，1996;87:369-375.
［4］Mazumder A，Cooney D，Agbaria R，Gupta M，Pommier Y.Inhibition of human immunodeficiency virus type I integrase by3’-azido-3’-deoxythymidylate ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:5721-5725.
［5］Gomez DE，Tejera AM，Olivero OA.Irreversible telomerase shortening by3’-azido-2’-3’-dideoxythymidine（AZT）treat-ment ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998;246:107-110.
［6］Murakami J，Nagai N，Shigemasa K，Ohama K.Inhibition of telomerase activity and cell proliferation by a transcriptase inhi-bition in gynaecological cancer cell line ［J］.Eur J Cancer，1999;35（6）:1027-1034.
［7］Melana SM，Holland JF，Pogo BG.Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by3’-azido-3’-dideoxythymidine ［J］.Clin Cancer Res，1998;4:693-696.
［8］Scanlon KJ，Funato T，Pezeshki B，Tone T，Sowers T.Poten-tiation of azidothmidine cytotoxicity in cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cells ［J］.Cancer Common，1990;2（10）:339-349.
［9］Zhu XL，Kumar R，Mandal M，Sharma N，Shannar HW，Ohin-gra U，Sokoloki JA，Hsiao R，Narayanan R.Cell cycle-depen-dent modulation of telomerase activity in tumor cells ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93;6091-6095.
［10］Faraoni I，Turriziani M，Nasci G.Decline in telomerase activity as a measure of tumor cell killing by antineoplastic agent in vitro ［J］.Clin Cancer Res，1997;3:579-585.