作者：杨瑞华 陈景元 邓中荣 刘秀红 郑刚 赵瑞刚
【关键词】 微波
关键词: 微波;视网膜神经节细胞;脂质过氧化;锌;猪
摘 要:目的 探讨微波对体外培养的猪视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤作用及耐受剂量，为进一步研究微波的眼底损伤机制及其防护提供一定的实验依据. 方法 体外培养猪视网膜神经节细胞，按微波辐照强度分为对照组，30mW・cm-2 组，60mW・cm-2 组及各辐照剂量加锌组，微波理疗机于微波屏蔽室内辐照1h，辐照后立即于光镜及电镜观察细胞形态变化，测定超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）活性. 结果 微波辐照后，细胞有聚集现象，部分细胞轴突消失，电镜可见线粒体及内质网肿胀，细胞MDA活性明显增高，SOD降低，加锌各组光镜下细胞形态变化不明显，电镜显示线粒体轻度肿胀，嵴完整，MDA活性有所恢复，SOD活性增高. 结论 微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤，锌可提高细胞的抗氧化能力，在一定程度上减轻微波对视网膜神经节细胞的过氧化损伤.
Keywords:microwave;retinal ganglion cells;lipid peroxida-tion;zinc;swine
Abstract:AIM To determine the lipid peroxidation damage in the primary cultured pig retinal ganglion cells induced by microwave and cells’tolerance to microwave in order to pro-vide some experiment foundation for study of mechanism of microwave damage and its protection.METHODS Pig reti-nal ganglion cells were cultured in vitro and pided into3groups of different radiation intensities（control group，30mW・cm-2 group，60mW・cm-2 group）and2more radiated groups with zinc added.The activity of intracellular superox-ide dismutase（SOD）and the content of malondialdehyde（MDA）were assayed after they had been radiated for1h in a shielded room by2450MHz continuous wave physiotherapy machine.The morphological variation of cells was observed immediately after radiation by optics microscope and trans-mission electronic microscope.RESULTS After radiation，some cells congregated and their axon disappeared.Mito-chondria and endoplasmic reticulum were detected swelling by transmission electronic microscope.The content of MDA was increased and SOD decreased clearly compared with control group.Cells had no obvious changes observed under optical microscope，but mitochondria swelling lightly and integrate mitochondria cristae by transmission could be found under electronic microscope while in zinc added groups，content of MDA recovered，and SOD increased.CONCLUSION The microwave can induce lipid peroxide damage to in vitro cul-tured retinal ganglion cells and zinc can improve antioxidative capacity of cells，and to some extent remedy microwave-in-duced damage of lipid peroxidation to retina ganglion cells.
0 引言
近年来随着微波在工农业生产，医疗卫生，通讯，家用电器以及军事等领域的广泛应用，微波的医学防护受到极大的关注.微波的损伤是多方面的，其中眼睛是敏感的重要靶器官.研究表明，微波可以对眼睛造成明显损害［1，2］ ，对机体的脂质过氧化过程有促进作用［3］ ，视网膜各层细胞内均有清除自由基的天然保护系统，包括抗过氧化物酶系统和天然的抗氧化剂［4］ .SOD是机体内广泛存在的一种重要的抗氧化物酶，它能特异性歧化超氧阴离子自由基，保护细胞免受脂质过氧化的损伤，锌作为SOD的必要组分，对体内自由基和过氧化脂质的清除起重要作用.研究锌对微波致视网膜神经节细胞损伤的防护作用具有重要意义.
1 材料和方法
1.1 材料 眼球来源于西安市肉联厂;木瓜蛋白酶（中科院上海生化所东风生化技术公司）;牛血清白蛋白（中国医学科学院血液学研究所）;DL-半胱氨酸，DMEM培养基（Gibco公司）;小牛血清（杭州四季青生物工程公司）;YJ-875医用净化工作台（苏州净化仪器厂）;TE-HER式数字式CO2 培养器（日本平泽制造厂）;WB-70微波理疗机（上海微波医疗仪器厂）;RL-761微波漏能测试仪（江苏宿迁无线电厂）;其他试剂均为分析纯.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 选用屠宰场宰杀后的猪立即摘取眼球，剪除周围结缔组织，清水充分洗涤，200kU・L-1 庆大霉素浸泡20min，移入超净工作台，沿眼球赤道部环形切开眼球，去除晶体及玻璃体，剥离并剪碎视网膜，加入含牛血清白蛋白（0.2g・L-1 ），DL-半胱氨酸（0.2g・L-1 ）、木瓜蛋白酶（430kat・L-1 ）的Hanks液中，于37℃消化40min［5］ .离心洗涤，接种于含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液中，37℃，50mL・L-1 CO
2 孵箱培养.
1.2.2 辐照条件 频率2450MHz连续波屏蔽室内辐照，室温19～20℃，相对湿度40%.细胞分为5组，分别为对照组（不受照射），30mW・cm 2 （Ⅰ组），60mW・cm-2 （Ⅱ组），各辐照剂量分别加硫酸锌10 μmol・L
-1 （Ⅲ，Ⅳ组）.
1.2.3 指标测定 ①细胞形态观察:光镜及电镜观察细胞，②SOD及MDA测定:收集细胞，PBS漂洗2～3次，调整细胞浓度为106 ・mL-1 ，超声粉碎，取100μL进行SOD（羟胺法［6］ ）和MDA（改良硫代巴比妥酸荧光法
［7］ ）测定.
统计学处理:SPSS软件进行t检验.
2 结果
2.1 光镜观察 细胞培养3～5d后，细胞贴壁，体积小，圆形，分散存在，有轴突伸展（Fig1）.微波辐照后，Ⅰ组细胞聚集成团，仍可见轴突，少数细胞散在，轴突消失，边缘较模糊，Ⅱ组细胞多数边界模糊，部分细胞漂浮，可见细胞碎片;Ⅲ组细胞与Ⅰ组无明显区别;Ⅳ组漂浮细胞少于Ⅱ组.
2.2 电镜观察 正常细胞（对照组）核大，细胞质少，染色质分散均匀，可见线粒体和内质网.微波辐照后，Ⅰ组细胞线粒体肿胀明显，嵴断裂、消失，可见凋亡细胞（Fig2）;Ⅱ组细胞坏死较多，细胞膜破裂，核膜破裂，线粒体、内质网扩张产生空泡（Fig3）;Ⅲ组细胞线粒体轻度胀大，嵴完整，核染色质分散良好;Ⅳ组细胞呈现过渡状态，及染色质浓缩，但核膜，细胞膜均完整.
图1 －图3 略
2.3 MDA含量与SOD活性 微波辐照后，MDA显著升高，且升高幅度与辐照强度呈一定的相关性，SOD活性降低.加锌组细胞MDA含量较辐照组明显下降，与对照组基本相近，SOD则呈现上升趋势，但未恢复到对照组水平（Tab1）.
微波对视网膜损伤的研究报道较少，且多为组织病理学损伤［1，2］ .
表1 各组每个细胞中MDA含量及SOD活性 略
我们以猪视网膜神经节细胞为对象研究微波辐照的损伤作用及其防护，结果表明:连续波辐照可导致体外培养的视网膜神经节细胞发生形态学变化.微波对神经节细胞形态学的影响最初表现为线粒体的损伤和神经轴突消失，且细胞在受到微波刺激后发生保护性聚集现象，30mW・cm -2 辐照1h可使神经节细胞发生聚集，且有凋亡细胞出现，随辐照功率的提高，细胞形态进一步遭到破坏.这种损伤在一定范围内是可以恢复的，培养液中加入硫酸锌时，30mW・cm -2 辐照细胞状态有明显改善，当辐照功率达到60mW・cm-2 时，细胞呈现退变状态，部分细胞表现为不可逆损伤，如核膜皱缩，线粒体、内质网空泡变性等.由此可见，30mW・cm-2 功率密度，辐照时间1h之内，0.1μmol・L -1 浓度的锌可以使损伤的细胞恢复正常，但随辐照功率的增大，这个浓度的锌则不足以修复损伤，仅表现为超微结构的改善，其防护作用及剂量仍需进一步研究.
微波辐照后，MDA含量随辐照强度增大而增高说明微波对神经节细胞的损伤涉及脂质过氧化反应，视网膜与脑组织的生物学特点极为相似［8］ ，即富含不饱和脂肪酸，视网膜细胞中有大量的线粒体及多种酶类，代谢功能非常活跃，易受自由基攻击.在微波辐照启动脂质过氧化反应的同时，超氧阴离子自由基（O2.- ）等自由基增加，造成生物膜损伤，特别是线粒体肿胀，可致酶的催化活性降低，抗氧化能力的减弱，氧化磷酸化受到抑制，能量产生障碍，进而使线粒体的多聚核糖核蛋白解聚脱落，抑制蛋白合成，溶酶体膜受损，释放出各种水解酶损伤组织，甚至引起细胞 死亡.SOD可清除O2-. ，其活性高低与体内过氧化物含量密切相关，且该酶为一种诱导酶，锌是其重要组分之一，故加锌辐照组SOD的催化活性有一定程度的升高，MDA含量有所降低可能与此有关，但SOD水平未达到辐照前水平，可能与锌的剂量不足和作用时间短有关.另外，细胞损伤程度亦与诱导作用的发挥强度有关.
以往关于微波的研究中，观察指标多集中在组织病理学方面，而对生理、生化方面的改变研究较少，本结果表明，微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤，锌可提高细胞的抗氧化能力，在一定程度上减轻微波对视网膜神经节细胞的过氧化损伤.这为探讨微波诱发眼疾的机制提供了实验依据，也为微波辐照的生物防护研究提供了思路.
参考文献
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