作者：秦瑞峰 顾晓明 秦晓春
【关键词】 骨骼肌
关键词: 骨骼肌;细胞凋亡;细胞分化
摘 要:目的 对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究. 方法 本实验采用体外培养的C2C12肌母细胞分化模型，用流式细胞仪检测肌细胞分化过程中细胞周期的变化，提取细胞基因组DNA进行电泳分析，用原位末端标记法进行了凋亡细胞染色，电子显微镜观察凋亡小体的形成. 结果 C2C12细胞在肌分化诱导24h和48h，检测出凋亡现象;而对照组、肌分化诱导72h组均未检出凋亡现象. 结论 在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，而且具有明显的时间性，终末分化的肌管不易出现凋亡.
Keywords:skeletal muscle;cell apoptosis;cell differentia-tion
Abstract:AIM To investigate apoptosis in the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells.METHODS Murine C2C12myoblasts differential model was used in this experiment;the changes of cell cycle was tested by flow cy-tometry;genomic DNA was extracted for analysis by elec-trophoresis;in situ end-labeling（ISEL）and electron micro-scope were used to detect the apoptosis.RESULTS After C2C12cells from cultures were incubated for24or48hours in differentiation medium，apoptosis was detected;but no apoptosis was found in control group and C2C12cells from cultures incubated for72hours in differentiation me-dium.CONCLUSION During the differentiation and devel-opment of skeletal muscle，a fraction of cells might be lost through apoptosis automatically，and this may be related to the time.Differentiated myotubes are possibly resistant to apotosis.
0 引言
细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领域，它作为一种细胞生理性的死亡方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用［1］ .凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，最终形成新月状小体;其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局［2］ .凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践.骨骼肌肌母细胞分化发育，首先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构［3］ .C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mL L-1 胚牛血清的DMEM培养基可诱导其分化［4］ ，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以及细胞周期发生明显变化［5］ .我们采用C2C12细胞模型，对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料 C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×10 5 L-1 ，接种于100mL L-1 胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mL L-1 CO2 孵育箱培养（37℃）.培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mL L-1 胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基DM（20mL L -1 胚牛血清的DMEM），分别于24，48和72h换为分化培养基的进行实验.
1.2 方法
1.2.1 流式细胞仪对细胞的检测 按文献［6］，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×10 6 mL-1 ，4℃PBS洗涤，700mL L-1 冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μg mL-1 碘化丙啶，1mL L -1 Triton X-100，0.1mmol L -1 EDTA（Na）2 ，50μg mL-1 Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，&>610nm滤色片检测，对细胞进行分析.
1.2.2 TUNEL法 按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行.常规细胞爬片，20μg mL-1 蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，最后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析.凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色.
1.2.3 电镜检测 常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察.
1.2.4 DNA的电泳分析 细胞经2.5g L-1 胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集.随之提取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20g L-1 琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录.
2 结果
2.1 肌细胞分化过程中细胞周期 C2C12肌细胞分化培养基培养48h的细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位于单倍体和二倍体峰之间（Fig1）.
图1 略
2.2 形态学观察和TUNEL法染色 光镜下观察，C2C12肌细胞GM培养24h可见少量凋亡细胞，胞核呈紫蓝色，GM诱导48h凋亡细胞数量增多，存活细胞部分开始融合.对照组、GM诱导培养72h组均未见凋亡细胞，后者肌细胞融合形成的肌管增多，肌管内含多个胞核的分化现象（Fig2）.
2.3 电镜观察 GM诱导培养24h和48h的C2C12肌细胞中，出现凋亡细胞，凋亡细胞核浆比例增大，核片段聚集成块堆聚在核膜周围（Fig3）.
2.4 细胞基因组DNA的电泳分析 肌细胞于分化培养基培养24h、细胞出现梯状DNA，尤以48h悬浮细胞显著（Fig4）.
图4 略
3 讨论
迄今已发现许多因素都可诱导细胞凋亡，生化机制还不十分明确［6］ .一般认为程序化细胞死亡过程中核DNA的降解是由于一种Ca2+ ，Mg 2+ 依赖性内切酶活化引起的［7，8］ .多细胞有机体的发生、发育有赖于细胞增殖、分化和死亡的精密结合，即细胞周期的正常运行，细胞的增殖和凋亡的平衡.对肌肉细胞凋亡现象的研究将对揭示肌细胞恶变、老化、退变性肌病等的发病机制及其治疗有重要意义.
FCM是检测细胞凋亡有效而灵敏的方法，为观察凋亡提供了新的手段［9］ ;凋亡细胞检测技术TUNEL法，是利用凋亡细胞生化特征的先进检测技术，具有很高的灵敏性.本实验中肌细胞分化的特定时期即肌母细胞在分化培养基培养24h和48h，TUNEL法染出了凋亡细胞，此外，DNA凝胶电泳分析出现反映核小体断裂的DNA梯状带.以上结果表明，在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，这在肌肉组织重建有积极的意义.另外，凋亡的发生具有明显的时间性，分化早期（24h）检测出凋亡细胞数量较少，可能原因是此期间为特异性基因开放期，分子水平反映活跃，形态改变不太显著;分化后期（72h）不再发生凋亡，主要原因在于诱导72h后肌母细胞已经融合形成肌管，肌管是终末分化的肌细胞，不能再进入细 胞分裂周期.不过，最近有的学者SV40大抗原引入肌管，终末分化的肌管重新进入细胞周期，出现减数分裂和凋亡，说明肌管仍具有凋亡发生的机制 ［10］ .
细胞凋亡时伴有多种基因转录和蛋白质合成.c-myc是调控细胞增殖的主要基因，c-myc的表达产物是一种转录因子，与细胞增殖分化及癌变有密切关系.Evan等［11］ 选用大鼠成纤维细胞Rat1/myc为实验模型研究发现，当有某些因素（低血清浓度，抑制细胞周期因子，抑癌基因）存在时c-myc基因的表达与细胞程序性死亡密切相关.本实验在诱导肌细胞分化时采用20mL L-1 血清的DMEM培养基，c-myc可能在细胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的调节过程的机制仍很不清楚.总之，肌母细胞分化、发育的过程中出现凋亡现象可能为保证肌肉发育成熟所必须，为清除不再需要的肌细胞提供了一个有效机制，它的研究对于肌肉系统疾病认识将有很大帮助.
参考文献
［1］Miyashita T，Reed JC.bcl-2oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line ［J］.Blood，1993;8（1）:151-156.
［2］Ueda N，Shah SV.Apoptosis ［J］.J Lab Clin Med，1994;124（2）:169-177.
［3］Walsh K，Perlman H.Cell cycle exit upin myogenic differentia-tion ［J］.Curr Opin Genet Dev，1997;7（5）:597-602.
［4］Qin RF，Gu XM，Zhang H.The affection of fetal bovine serum concentration on the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells in vitro ［J］.Shiyong Kouqiang Yixue Zazhi（J Pract Stomatol），2000;16（1）:14-16.
［5］Qin RF，Gu XM，Huang FG，Zhang H.Analysis of cell cycle and DNA synthesis during myocytic differentiation by flow cy-tometry ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），2000;21（8）:921-923.
［6］Telford WG，King LE，Fraker PJ.Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associat-ed chromatin degradation by flow cytometry ［J］.Cytometry，1992;13（2）:137-142.
［7］Surh CD，Sprent J.T-cell apoptosis detected in situ during posi-tive and negative selection in the thymus ［J］.Nature，1994;372（6501）:100-103.
［8］Zhivotovsky B，Wade D，Nicotera P.Role of nucleases in apop-tosis ［J］.Int Arch Allergy Immunol，1994;105（4）:333-338.
［9］Telford WG，King LE，Pamela JF.Rapid quantitation of apop-tosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cy-tometry ［J］.J Immunol Methods，1994;172（1）:1-16.
［10］Endo T，Nadal GB.Reversal of myogenic terminal differentia-tion by SV40large T antigen results in mitosis and apoptosis ［J］.J Cell Sci，1998;111（pt8）:1081-1093.
［11］Evan GI，Wyllie AH，Gilbert CS.Induction of apoptosis in fi-broblasts by c-myc protein ［J］.Cell，1992;69（1）:119-128.