【摘要】 目的 研究室旁核（paraventricular nucleus， PVN）内注射血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， AngⅡ)对大鼠胃缺血/再灌注(gastric ischemia/reperfusion， GI/R)后的胃黏膜核因子κB（NF-κB） 表达的影响。方法 采用核团微量注射法以及夹闭大鼠腹腔动脉30 min后松开动脉夹血流复灌1 h的GI/R模型，计数胃黏膜损伤指数并应用免疫组化方法检测胃黏膜NF-κB p65的表达。结果 ①GI/R可引起胃黏膜损伤，PVN内微量注射AngⅡ（0.3 μl含30 ng）后GI/R损伤显著减轻；侧脑室注射（icv）AngⅡ受体拮抗剂洛沙坦，能阻断AngⅡ对GI/R损伤的保护作用，使GI/R损伤明显加重;②正常大鼠胃黏膜可见NF-κB表达，并主要在胞质表达;GI/R后，NF-κB表达增多，尤其是胞核表达明显增加;PVN内微量注射AngⅡ后，可使胃黏膜NF-κB表达量减少； icv 给予洛沙坦可阻断AngⅡ的效应，即GI/R损伤后胃黏膜NF-κB 阳性细胞数表达量增加。结论 PVN内微量注射AngⅡ对大鼠GI/R损伤有明显的保护作用，且该作用可被洛沙坦翻转;NF-κB 在PVN内微量注射AngⅡ减轻大鼠GI/R损伤过程中可能发挥着重要作用。
【关键词】 室旁核 胃缺血 再灌注 血管紧张素 核因子κB
Abstract:Objective To study the effect of angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) in the paraventricular nucleus (PVN) on the expression of NF-κB in gastric mucosa following gastric ischemia/reperfusion (GI/R) in rats.Methods Intranuclear microinjection and model of GI/R were employed in the experiment． The GI/R model was established by clamping the celiac artery for 30 min to induce ischemia and allowing reperfusion for 1 h. The animals were finally sacrificed to investigate the gastric mucosal damage index and the expression of NF-κB in the gastric mucosa by immunohistochemistry.Results ① GI/R induced gastric mucosal injury; microinjection of AngⅡ（30 ng）into PVN obviously attenuated the GI/R injury; intracerebroventricular injection (icv) of losartan， an AngⅡAT1 receptor antagonist， could eliminate the protective effect of AngⅡagainst the I/R-induced gastric mucosal injury. ② NF-κB (p65) was mainly expressed in the cytoplasm in the middle and bottom layers of gastric mucosa in normal rat， NF-κB was obviously expressed in both nucleus and cytoplasm and translocated to the nuclei of gastric mucosal cells after 1 h of I/R. Microinjection of AngⅡ(30 ng) into the PVN significantly suppressed the translocation of p65 to the nuclei， and losartan blocked the effect of AngⅡ. The expression of NF -κB varied with the changes of the gastric mucosal damage index.Conclusion Microinjection of AngⅡ into the PVN protects against GI/R injury， and the protective effect of AngⅡ can be reversed by losartan. NF -κB may play an important role in the PVN， where AngⅡ mediates the protection against GI/R injury .
Key words: paraventricular nucleus (PVN); gastric ischemia/reperfusion (GI/R); angiotensin Ⅱ(AngⅡ); nuclear factor κB（NF -κB） 我们以往的研究表明，下丘脑室旁核（paraventricular nucleus， PVN）是调控胃缺血/再灌注(GI/R)损伤特异性中枢核团之一［1－2］。现已发现，在下丘脑室旁核小细胞区内有丰富的血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， AngⅡ)神经元胞体，并分布有高密度的Ang Ⅱ的Ⅰ型(AT1 )受体［3］，但PVN内的Ang Ⅱ对GI/R损伤是否具有调控作用尚未见报道。
目前有研究显示，胃黏膜核因子κB(NF-κB)在心、脑等器官的缺血/再灌注损伤过程中起到重要的作用， NF-κB 活化被认为是介导或加剧缺血/再灌注损伤的中心环节。缺血/再灌注时发生的缺血、缺氧等可以刺激NF-κB活性增加［4－5］。由此，我们推测在GI/R损伤中NF-κB p65可能起到重要的作用；但在PVN内的AngⅡ对GI/R损伤的调控作用中， NF-κB起到何种作用尚不明确。因此，本实验采用大鼠GI/R模型，通过PVN微量注射AngⅡ，运用免疫组化方法观察NF-κB p65在大鼠胃黏膜的变化规律，以明确PVN微量注射AngⅡ对大鼠 GI/R损伤的影响及NF-κB在其中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验试剂 AngⅡ购自Sigma 公司，洛沙坦购自默沙东公司，NF -κB p65(小鼠单克隆抗体)购自Santa Cruz 公司，Power Vision 二步法免疫组化检测试剂（PV- 6002）购自北京中杉生物技术有限公司，其他常用试剂均为国产分析纯。
1.2 实验动物和分组 成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(230±20) g，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。实验前禁食24 h，自由饮水。将实验动物随机分为4组:GI/R组（Sham组）、溶剂对照组（Vehicle组）、AngⅡ+GI/R组（AngⅡ组）、洛沙坦+AngⅡ+GI/R组（Los+AngⅡ组）。
1.3 核团微量注射 实验时以10％的水合氯醛（0.3 ml/100 g， ip）麻醉，按Paxinos和Watson大鼠脑图谱［6］定位LV（AP 1.0 mm， R 1.5 mm， H 3.8 mm）后，使用0.5 μl微量注射器，在2 min内将0.3 μl洛沙坦缓慢注入，留针5 min，拔针10 min后，仍按以上脑图谱定位PVN（AP 1.5 mm，R 0.4 mm，H 7.7～7.8 mm），按上述方法注入0.3 μl AngⅡ后，留针5 min，拔针10 min后进行GI/R。对照组以同样方法注射等量溶剂。
1.4 GI/R模型的制备 按Wada等［7］方法，大鼠经核团微量注射后，开腹，分离并夹闭腹腔动脉30 min，去除动脉夹恢复血流。于再灌注后的1 h处死动物，快速取胃。一部分胃刮取胃黏膜置于-80℃冰箱保存备用，另一部分胃固定于10％的中性甲醛作常规石蜡切片。
1.5 胃黏膜损伤指数测定 参照Guth等［8］方法加以改进，以局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡和出血灶的长度累积计分：正常为0分；损伤≤1 mm计1分；＞1 mm并≤2 mm 计2分，＞2 mm并≤3 mm 计3分，余类推。损伤宽度超过1 mm时加倍计分。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。
1.6 免疫组化测定 石蜡组织切片常规脱蜡至水，3％过氧化氢室温孵育10 min以阻断内源性过氧化酶，微波修复抗原(98℃，15 min)，正常羊血清封闭液室温孵育10 min，滴加一抗（NF-κB p65）4℃过夜，次日滴加PV- 6002（山羊抗小鼠IgG抗体－HRP多聚体），DAB室温显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。阴性对照以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗而其他条件均相同。光镜下观察到胞质或胞核内有棕色颗粒者，即为阳性细胞。以高倍视野下胞核阳性细胞数作为分析指标。每例3张间断取片，每张切片随机选取10 个视野，取平均值。
1.7 统计学处理 全部数据采用SPSS 13.0统计分析软件处理， 数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析法， P&<0.05 表示差异有显著性。
2 结 果
2.1 PVN内微量注射AngⅡ对GI/R损伤的影响 GI/R 组的胃黏膜损伤指数与Vehicle 组相比，可见2组胃黏膜的损伤程度无显著性差异(P＞0.05)。与Vehicle组相比， PVN内微量注射AngⅡ后，GI/R损伤的程度明显减轻(P＜0.05)；而侧脑室注射洛沙坦后可阻断AngⅡ对GI/R损伤的保护作用，胃黏膜损伤明显加重(P＜0.05)（表1）。
2.2 PVN内微量注射AngⅡ对NF-κB在大鼠胃黏膜表达的影响
2.2.1 NF-κB p65免疫组化染色 正常大鼠胃黏膜内NF-κB p65 蛋白主要表达在黏膜中下层，且主要在胞质表达，胞核表达较少（图1A）;GI/R后促使细胞内NF-κB发生核转位，胞核内表达明显增加（图1B）;PVN内微量注射AngⅡ后，NF-κB在胞核表达显著降低（图1C）;侧脑室给予洛沙坦后，AngⅡ对GI/R损伤的保护作用被阻断，胃黏膜损伤加重，促使NF-κB发生核转位，在胞核内表达又明显增多（图1D）。表1 PVN微量注射Ang Ⅱ对GI/R损伤的影响
2.2.2 NF - κB p65 免疫组化染色 NF-κB在Sham组胞核内表达量较少，而在Vehicle组其表达量明显增加（P＜ 0.05）。与Vehicle组相比，AngⅡ组核内NF-κB的表达量又显著减少（P＜0.05）。洛沙坦可阻断AngⅡ的这种效应，Los+AngⅡ组NF-κB核内表达量又明显增加(P＜0.05)(表2)。表2 PVN微量注射AngⅡ对大鼠胃黏膜NF-κB表达的影响与Sham组比较:*P&<0.05，**P&<0.01；与Vehicle组比较:##P&<0.01；与AngⅡ组比较:△P&<0.05
3 讨 论
AngⅡ是肾素－血管紧张素系统（RAS）的主要活性肽，它既是一种循环激素，又是脑内重要的应激激素之一，与机体的氧化应激反应密切相关。研究发现，在大鼠冷-束缚应激期间，脑内肾素和AngⅡ的水平增加，下丘脑PVN内小细胞上AngⅡ的Ⅰ型受体（AT1-R）也增加［9］，表明脑内AngⅡ对应激性胃黏膜损伤的调控起重要作用。GI/R损伤和应激性胃黏膜损伤在性质上是相似的，即都是由氧化应激引起的胃黏膜损伤［1］。那么PVN内微量注射AngⅡ对GI/R损伤是否也起重要调控作用？这是我们感兴趣的问题。
本实验观察到，GI/R可引起胃黏膜损伤，PVN内微量注射AngⅡ后，GI/R损伤显著减轻；侧脑室给予AT1受体拮抗剂洛沙坦，能阻断AngⅡ对GI/R损伤的保护作用，使GI/R损伤明显加重。结果表明PVN内微量注射AngⅡ是通过PVN内的AT1受体起作用，从而减轻大鼠GI/R损伤。
GI/R导致的胃黏膜损伤实际上是一种氧化应激反应，在缺血-缺氧、氧自由基、肿瘤坏死因子-α等胞外刺激信号的作用下，可激活NF-κB信号蛋白通路。NF-κB是一种普遍存在的诱导型核转录因子，静息状态下，NF-κB多以p50和p65二聚体与其抑制蛋白IκB相结合而存在于胞质，呈无活性状态。胞外刺激通过一系列信号转导引起IκB降解，导致NF-κB-IκB复合物解体，NF-κB得到活化，借助于被暴露出来的核定位信号进入细胞核，在核内与靶基因的特异序列结合并启动转录发挥其调控作用［10］。然而NF-κB 在各类细胞中所导致的生物学反应是不同的，在一些细胞内它可以引起细胞的增殖， 相反则促进了细胞的凋亡［11］。
本实验发现，正常胃黏膜在胞质可见NF-κB表达；GI/R后，NF-κB在胞核内表达明显增加；PVN内微量注射AngⅡ后，胃黏膜NF-κB表达量减少；侧脑室给予洛沙坦可阻断AngⅡ的效应，GI/R损伤后胃黏膜NF-κB表达量又显著增加。 可见NF-κB 活化程度与大鼠GI/R损伤具有同步性，胃黏膜损伤加重时，NF-κB表达量增加。
由此可见，NF-κB在PVN内微量注射AngⅡ对大鼠GI/R损伤保护作用中可能发挥着重要作用。故在目前防治器官缺血/再灌注损伤中，NF-κB的激活与抑制正成为当今新药研究与开发的一个新的靶点。
参考文献
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