作者：陈卫花，程慧敏，孔庆兖，李龙飞，贾晓民
【摘要】 目的 观察TGF-β1 、TβRⅡ、Smad2、E-cad、E-sel、integrin-β1、ICAM-1及CD44v6在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达特征，探讨其与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM分期及淋巴结转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP和SABC法检测TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、E-cad、 E-sel、integrin-β1、ICAM-1及 CD44v6的表达，并对其与NSCLC临床病理因素的关系进行分析。结果 TGF-β1与integrin-β1在肺腺癌组织的阳性表达率显著高于肺鳞状细胞癌组织(P&<0.05)， E-cad在肺腺癌组织的阳性表达率显著低于肺鳞状细胞癌组织(P&<0.05)。TGF-β1及TβRⅡ在NSCLC TNM分期Ⅰ期组织的阳性表达率显著低于Ⅱ期和Ⅲ期组织 (P&<0.01)。TGF-β1、TβRⅡ、Smad2及 CD44v6在有淋巴结转移的NSCLC组织中阳性表达率显著高于无淋巴结转移的NSCLC组织（P&<0.05）， E-cad在有淋巴结转移的NSCLC组织中阳性表达率显著低于无淋巴结转移的NSCLC组织（P&<0.05）。结论 TGF-β1、E-cad及integrin-β1与NSCLC的组织学类型有关，TGF-β1及TβRⅡ能促进NSCLC的病程进展；TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad、及 CD44v6的阳性表达与NSCLC的淋巴结转移密切相关，TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、E-cad及CD44v6在NSCLC的淋巴结转移中起着重要的促进作用，可作为估计NSCLC可能有淋巴结转移的指标。
【关键词】 非小细胞肺癌； TGF-β信号通路；细胞黏附分子；免疫组织化学；淋巴结转移;组织学类型
Abstract: Objective To investigate the relationship between the expression of TGF-β1，TβRⅡ，Smad2， E-cad， E-sel， integrin-β1， ICAM-1 and CD44v6， and the tissue type， TNM stages and lymph node metastasis in human NSCLC. Methods Immunohistochemical methods (SP and SABC) were used to examine the expressions of the eight indexes mentioned above and the results were processed statistically to reveal their correlations with the clinicopathological characters of NSCLC. Results The expressions of TGF-β1 and integrin-β1 were higher in adenocarcinoma than those in squamous carcinoma of lung (P&<0.05); the expression of E-cad was lower in adenocarcinoma than in squamous carcinoma (P&<0.05); the expressions of TGF-β1 and TβRⅡwere higher in TNM stagesⅠthan those in TNM stagesⅡand Ⅲ of NSCLC (P&<0.01). However， the lymph node metastasis was positively correlated with the expressions of TGF-β1， TβRⅡ， Smad2 and CD44v6， but negatively with the expression of E-cad in NSCLC (P&<0.05). Conclusion TGF-β1， E-cad and integrin-β1 are distinctly correlated with the tissue type of NSCLC; TGF-β1 and TβRⅡ accelerate the progress of NSCLC. The expressions of TGF-β1， TβRⅡ， Smad2， E-cad and CD44v6 are correlated with lymph node involvements in NSCLC， promoting lymph node metastasis， and can be taken as the indexes indicating the possibility of lymph node metastasis.
Key words: non-small cell lung carcinoma; transforming growth factor beta signaling; cellular adhesion molecules; immunohistochemistry; lymph node metastasis; tissue type
TGF-β(transforming growth factor -β)家族和细胞黏附分子（cellular adhesion molecules，CAMs）是近年倍受关注的与非小细胞肺癌淋巴结转移有关的因素。TGF-β家族是为数不多的内源性细胞生长调节蛋白，它们是调节细胞增殖、分化、迁移、免疫反应、血管生成及凋亡的多肽生长因子。许多研究发现，TGF-β1信号通路能够促进肿瘤发生、浸润和转移的进程［1-2］。
细胞黏附分子包括选择素家族、免疫球蛋白超家族、整合素家族、钙粘素家族以及一些未归类的家族如CD44家族，它是细胞膜上的一类跨膜糖蛋白， 能够介导肿瘤细胞与细胞外基质、血管内皮细胞及实质器官组织细胞或与其他肿瘤细胞之间的相互作用， 与肿瘤的侵袭转移关系密切［3］。
本实验采用免疫组织化学技术检测了TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、E-cad、E-sel、integrin-β1、ICAM-1及CD44v6在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达，进一步探讨其与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM分期及淋巴结转移的关系，以期为临床判定非小细胞肺癌患者的淋巴结转移提供客观依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 临床材料 徐州医学院第二附属医院病理科自1995年至2004年10年间存档的原发性非小细胞肺癌手术后的石蜡组织标本56例，其中男37例，女19例，年龄36～81岁。肺癌组织学分类依据WHO标准分类，其中腺癌36例，鳞状细胞癌20例。TNM分期: Ⅰ期36例， Ⅱ期8例， Ⅲ期12例，Ⅳ期0例。其中手术切除后病理检查证实有肺门或纵隔淋巴结转移的25例，未转移者31例。所有病例术前均未经放射或化学治疗。
1.1.2 主要试剂 鼠抗人TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad及CD44v6单克隆抗体，SP试剂盒（即用型），DAB二氨基联苯显色剂试剂盒，PBS液等，购自福州迈新生物技术开发有限公司。兔抗人浓缩液intergrin-β1、ICAM-1及E-sel单克隆抗体（工作浓度1∶100），SABC试剂盒（即用型），DAB二氨基联苯显色剂试剂盒，PBS液等，购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 全部组织均经10 %甲醛液固定后取材，进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每个组织蜡块4 μm厚连续切片9张。1张用于常规苏木精- 伊红染色，其余8张用于免疫组织化学染色。
1.2.2 免疫组织化学染色 SABC法及SP法。每组染色，设立已知的阳性对照片为阳性对照、PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.2.3 染色结果判定标准 定性:至少观察5个400倍的视野，&>5%的肿瘤细胞的细胞膜或（和）细胞质染成棕黄色为阳性，否则为阴性。 定位 : TGF-β1、E-sel、integrin-β1及ICAM-1的表达定位在细胞质，TβRⅡ、Smad2、E-cad及CD44v6的表达定位在细胞膜和细胞质。
1.3 统计学处理 统计数据采用四格表χ2检验或确切概率法，应用Stata软件进行数据处理，检验水准:α=0.05 。
2 结 果
2.1 TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、E-cad、E-sel、integrin-β1、ICAM-1及CD44v6在NSCLC中的表达 TGF-β1、E-sel、integrin-β1及ICAM-1表达于肿瘤细胞的细胞质（图1、2、3、4）。TβRⅡ、Smad2、E-cad及CD44v6表达于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质（图5、6、7、8）。
2.2 TGF-β1、TβR Ⅱ、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-β1、 ICAM-1及 CD44v6在肺腺癌及肺鳞状细胞癌中的表达 由表1可见，TGF-β1及integrin-β1在肺腺癌组织中的表达阳性率分别为57%(20/35) 、83%(29/35)，显著高于其在肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率24%(5/21)、52%(11/21)，有显著性差异（P&<0.05）；而E-cad在肺腺癌组织中的表达阳性率6%(2/35)显著低于其在肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率29%(6/21)，有显著性差异（P&<0.05）;TβR Ⅱ、Smad2、E-sel、 ICAM-1及 CD44v6在肺腺癌组织中的表达阳性率与肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率无显著差别（P&>0.05）。表1 各指标在肺腺癌及肺鳞状细胞癌中的表达
2.3 TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-β1、 ICAM-1及 CD44v6在不同TNM分期中的表达 由表2可知，TGF-β1、TβRⅡ在NSCLC TNM分期Ⅰ期组织中的表达阳性率为25%(9/36) 、28%(10/36)，显著低于Ⅱ、Ⅲ期组织中的表达阳性率80%(16/20) 、85%(17/20)，差异显著（P&<0.01）。Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-β1、 ICAM-1及 CD44v6在NSCLC TNM分期Ⅰ期组织中的表达阳性率与Ⅱ、Ⅲ期组织中的表达阳性率无显著差别（P&>0.05）。
2.4 TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-β1、 ICAM-1及CD44v6的表达与NSCLC淋巴结转移的关系 表3显示，TGF-β1、TβRⅡ、Smad2及 CD44v6在有淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率为72%（18/25）、80%（20/25）、64%（16/25）及80%（20/25），显著高于无淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率24%（7/31）、24%（7/31）、36%（11/31）及29%（9/31），统计学显示有显著性差异（P&<0.05）；而E-cad在有淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率为16%（4/25），显著低于无淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率65%（20/31），有显著性差异（P&<0.05）。E-sel、integrin-β1及ICAM-1在有淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率与无淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率无显著差别（P&>0.05）。表2 各指标在不同TNM分期中的表达表3 各指标表达与NSCLC7淋巴结转移的关系
3 讨 论
近来研究表明，TGF-β家族和细胞黏附分子在非小细胞肺癌进展及淋巴结转移中起着重要的作用。本实验重点检测TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-β1、 ICAM-1及 CD44v6在非小细胞肺癌中的表达，观察它们与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM分期及淋巴结转移的关系。
TGF-β是一类相对分子质量为25×103的二聚体多肽生长因子，它共有5 种同分异构体(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5)，哺乳类动物中有3 种(TGF-β1 、TGF-β2、TGF-β3) ，其中以TGF-β1 最具有代表性。TGF-β是以无活性的TGF-β前体分子形式分泌的，只有活化后的TGF-β和受体结合才能发挥其生物活性。TGF-β受体( TβR) 有3 种，即TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ，但只有Ⅰ、Ⅱ型是TGF-β信号通路必须的。TβRⅠ、TβRⅡ都是跨膜糖蛋白，有胞外区(近膜侧有保守的“Cys 盒”) 、跨膜区和胞质内区(具有丝/苏氨酸激酶活性)。其中TβRⅡ胞内羧基端有一个富含丝/ 苏氨酸残基的短尾而无GS（Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 序列）区，可以在无配体结合的条件下发生自体磷酸化，并能与游离的TGF-βs结合，激活TGF-βⅠ型受体，使TGF-βⅠ型受体磷酸化，激活Smads。Smads 是介导TGF-β超家族受体到核基因的信号传递蛋白家族。目前发现哺乳动物Smads 有8 种(Smad1～Smad8)，典型的Smads 蛋白由三部分组成，氨基端和羧基端高度保守的MH1和Mh3 结构域，其间有富含脯氨酸的间隔区(Linker)也即居中连接区。MH1区是DNA结合区；Mh3区是效应区，参与Smad与受体的结合，并具有转录激活功能。根据结构和功能的不同Smads分为三类:第一类是R-Smads，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5， Smad8;第二类是Co-Smads，包括Smad4/DPC4( deleted in pancreatic carcinoma 4);第三类为anti-Smads，包括Smad6、Smad7。其中Smad2～Smad4、Smad7参与TGF-βs的信号转导，使TGF-β信号与基因表达偶联。
本研究结果显示:①TGF-β1在肺腺癌组织中的表达阳性率显著高于肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率，提示TGF-β1在不同组织学类型中的表达是不同的。此结果与Hasegawa等［4］研究表明TGF-β1的表达与肺腺癌显著相关的结果一致，但具体机制尚不清楚，有待于进一步的研究。TβRⅡ与Smad2在肺腺癌组织中的表达阳性率与肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率无显著差异，提示TβRⅡ及Smad2的表达与NSCLC的组织类型无密切关系。②TGF-β1及TβRⅡ在NSCLC的TNM分期Ⅰ期组织中的表达阳性率显著低于Ⅱ、Ⅲ期组织中的表达阳性率，提示TGF-β1及TβRⅡ促进NSCLC的进展。此结果与Kim等［5］研究表明TGF-β1在NSCLC TNM分期Ⅲ期组织中的表达明显升高（P=0.03）、Kang等［6］认为TGF-β信号转导途径有助于肺癌的进展及Ueki等［7］研究表明TGF-β1在肺癌的表达与肺癌进展呈正相关的结果相一致，这可能与在细胞恶变时，TGF-β信号转导途径中的成员发生改变，导致肿瘤细胞对TGF-β的生长抑制产生耐受，使肿瘤细胞生长失去控制有关；而与Zhang等［8］研究发现TβRⅡ的表达在阻止肺癌的进展中具有决定性意义的结果不一致，且Smad2在NSCLC的TNM分期Ⅰ期组织中的表达阳性率与Ⅱ、Ⅲ期组织中的表达阳性率无显著差异。提示TGF-β1、TβRⅡ及Smad2在NSCLC的进展中所起确切作用有待于进一步的研究。③TGF-β1、TβRⅡ及Smad2在有淋巴结转移的NSCLC中表达阳性率显著高于无淋巴结转移的NSCLC。提示TGF-β1、TβRⅡ及Smad2的阳性表达与NSCLC的淋巴结转移密切相关，在NSCLC的淋巴结转移过程中起着重要的促进作用。此结果与Hasegawa等［4］研究中有淋巴结转移的NSCLC患者其TGF-β1蛋白水平显著高于无淋巴结转移的患者（P=0.02）结果相一致。这可能与:TGF-β能够通过诱导肿瘤细胞周围其他细胞旁分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促进血管生成刺激晚期肿瘤生长及增加肿瘤的侵袭和转移能力；TGF-β可以减少某些ECM降解酶的生成（包括胶原酶、基质纤维酶）增加某些抑制降解酶的蛋白产生（如纤溶酶原活化抑制因子），肿瘤细胞中TGF-β生成增加，使蛋白水解酶活性增强，导致肿瘤细胞的侵袭能力增强；TGF-β能抑制Th1型细胞免疫，增强Th3型细胞免疫，而Th1型细胞免疫在抗肿瘤的细胞免疫中起着积极的作用，Th3型细胞免疫对肿瘤免疫起着负面作用，使肿瘤能动性抑制机体免疫，实现免疫逃逸，增加肿瘤的侵袭和转移的概率有关。
细胞黏附分子包括选择素家族、免疫球蛋白超家族、整合素家族、钙粘素家族以及一些未归类的家族如CD44家族。
钙黏蛋白(Cadherin) ［9～12］是一类钙离子依赖的黏附分子家族。在人类至少有10 多种钙黏附蛋白，其中与肿瘤免疫关系密切的有E-cad、N-cad和P-cad三类， E、N 和P 分别表示上皮、神经和胎盘来源。Kadowaki等［13］证明，食管癌中E-cad减少与肿瘤的淋巴结转移有关。
本研究结果中:①E-cad在肺腺癌组织中的表达阳性率显著低于肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率，提示E-cad表达下调或缺失与NSCLC的组织学类型有密切关系，但是具体机制尚不清楚，有待于进一步研究。②E-cad在有淋巴结转移的NSCLC中表达的阳性率显著低于无淋巴结转移的NSCLC。提示E-cad的阳性表达与NSCLC的淋巴结转移密切相关，E-cad在NSCLC的淋巴结转移过程中起着重要的促进作用。这可能与钙黏附蛋白分子在分子与分子连接方面具有特异性，并参与选择性细胞黏附，它的失活引起细胞-细胞连接的破坏使肿瘤细胞丧失黏附能力而发生转移有关。本实验未发现E-cad在NSCLC的TNM分期中的显著作用，这可能与我们的实验标本量较少有关。
选择素(selectin) ［9，14］包括L-sel(CD62L )、P-sel(CD62P )、E-sel(CD62E) 三个成员。Stone等［15］研究发现P-sel可介导肿瘤细胞与激活的血小板黏附，促进肿瘤转移。周同等［16］研究发现黏附分子P-sel与肾癌的病情发展有关。E-sel是存在于血管内皮细胞表面的一种黏附分子。本实验未发现E-sel的表达与NSCLC的组织学分类、TNM分期及淋巴结转移有关。
整合素(integrin)［12，17］是一组二价离子依赖性细胞表面糖蛋白， 介导细胞间及细胞与细胞外基质的黏附反应， 每种整合素都是由α、β亚基以非共价健结合而成的异二聚体。已发现7种α亚基单位， 11 种β亚单位， 可形成至少20 种整合素。Albelda等［18］等研究结果显示，α6表达下降及α4表达增强与肿瘤转移关系密切。本研究结果显示，integrin-β1在肺腺癌组织中的表达阳性率显著高于肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率，提示integrin-β1在不同组织学类型中的表达是不同的，但其具体机制尚不清楚。本实验未发现integrin-β1的表达与NSCLC的TNM分期及淋巴结转移有关系，故integrin-β1在NSCLC中的确切作用需要作进一步的研究。
CD44 是一条糖基化的跨膜多肽链。仅含组成型外显子的CD44 转录子称作标准型CD44s(standtrd form CD) 。CD44 基因的一个突出特点是该基因转录过程中只有10 个组成型外显子固定表达，而V 区外显子可以通过不同选择性剪切插入相应的mRNA 链中，形成一组不同的CD44 转录子，即CD44 的基因拼接变构体，主要包括CD44变异体（cluster of differentiation，CD44v6）。Mackay、Gorham、Günthert等［21～23］研究证实CD44v6的表达有助于肿瘤的转移。本研究结果显示，CD44v6在有淋巴结转移的NSCLC中表达的阳性率显著高于无淋巴结转移的NSCLC，提示CD44v6的阳性表达与NSCLC的淋巴结转移密切相关，CD44v6在NSCLC的淋巴结转移过程中起着重要的促进作用。此结果与Hirata等［24］ 研究结果相一致，这可能与:①CD44v6促进肿瘤细胞间较弱的同质黏附从而促进肿瘤微瘤栓的形成；②在肿瘤转移过程中，循环系统中的肿瘤细胞必须首先黏附于脉管(血管和淋巴管) 的内皮细胞， CD44v6则促进肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附；③CD44v6促进肿瘤细胞外基质的降解，刺激新生血管的生成，促进肿瘤细胞的侵袭等有关。本实验未发现CD44v6的表达与NSCLC的组织学分类及TNM分期有关系，因此，CD44v6在NSCLC中的确切作用需要作进一步的研究。
综上所述，TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-β1、 ICAM-1及 CD44v6在NSCLC中的表达与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM分期及淋巴结转移的关系是不一样的，其中TGF-β1、E-cad及integrin-β1与NSCLC的组织学类型有关；TGF-β1及TβRⅡ能促进NSCLC的病程进展；TGF-β1、TβRⅡ、Smad2、 E-cad及CD44v6表达与非小细胞肺癌淋巴结转移的关系比较密切，可为临床判定非小细胞肺癌可能有淋巴结转移的提供客观依据。
【
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