【摘要】 目的 探讨灵芝对在高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞（MCs）表达基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-2组织抑制剂(TIMP-2)的影响。方法 大鼠MCs在高糖培养下，予不同质量浓度灵芝、苯那普利刺激后，运用免疫组织化学技术和图像分析法，观察MCs表达MMP-2和TIMP-2的变化， RT-PCR 检测MMP-2、TIMP-2 mRNA表达水平。结果 不同质量浓度的灵芝对高糖培养的大鼠MCs MMP-2和TIMP-2表达的影响不同。与高糖组相比，随着灵芝浓度逐渐增加，MMP-2的表达逐渐增加，TIMP-2的表达逐渐降低。结论 灵芝通过改变高糖培养的大鼠MCs MMP-2和TIMP-2的表达量，影响糖尿病肾病（DN）的进程。
【关键词】 灵芝;基质金属蛋白酶-2; 基质金属蛋白酶-2组织抑制剂;系膜细胞;大鼠；糖尿病肾病
Abstract:Objective To investigate the effect of Ganoderma lucidum on the expressions of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) by rat glomerular mesangial cells (MCs) cultured under high-glucose environment.Methods The culture of rat MCs was continued under high glucose level for 48 h before the experiment. Following the addition of Ganoderma lucidum of varied concentrations or benazepril， the changes in the expression of MMP-2 and TIMP-2 in the MCs and the mRNA levels of them were examined by immunohistochemical method， image analysis and RT-PCR respectively.Results The levels of MMP-2 and TIMP-2 were found varying with the concentration of Ganoderma lucidum， i.e. MMP-2 increased and TIMP-2 decreased with the increase of Ganoderma lucidum concentration.Conclusion Ganoderma lucidum may modulate the process of diabetic nephropathy by changing the expression of MMP-2 and TIMP - 2.
Key words: Ganoderma lucidum; matrix metalloproteinase-2; tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2; mesangial cells; rat; diabetes nephropathy
灵芝作为我国的传统的扶正固本、滋补强壮中药， 用于临床已有悠久的历史。临床和药理研究表明， 灵芝具有多种生理活性和药理作用［1］。有证据表明灵芝(Ganoderma lucidum， GL)能明显降低糖尿病（DM）大鼠的尿微量白蛋白排泄率及形态学异常，并在某种程度上抑制了TGF-β1的表达和合成，表明灵芝对DM大鼠早期肾脏病变有一定的作用［2］。为进一步研究GL对DM早期肾脏病变的作用效果及其机制作出初步的探索，本课题以GL、苯那普利对高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cells， MCs）进行干预， 观察MCs表达基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2， MMP-2)及基质金属蛋白酶-2组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2， TIMP-2)的变化，旨在探讨其治疗糖尿病肾病（DN）可能的作用机制，为扩大该药的临床应用范围提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料 兔抗人MMP-2、TIMP-2多克隆抗体(武汉博士德公司) ; SABC 免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司); 总RNA提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒（大连宝生生物工程有限公司）；大鼠MCs由上海长征医院内肾科提供；GL购自保定施达科生物工程技术有限公司，溶于加热的10%的DMEM培养基，配制不同浓度(150、300、600 mg/L)的溶液，无菌过滤待用；苯那普利（benazepril，由瑞士诺华制药有限公司生产）；DMEM培养基为Gibco公司产品；胎牛血清（FBS）为杭州四季青生物工程研究所产品；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶均为Sigma公司产品。
1.2 大鼠MCs的培养和分组 大鼠MCs常规培养于含10% FBS的生理糖（5.0 mmol/L葡萄糖）DMEM 中，5%CO2 ， 37℃条件下培养3～4天后，用0.25% 胰蛋白酶消化传代。 取处于对数生长期的MCs接种于培养板中，达80%融合后予无血清的DMEM培养基同步静止24 h，在加或不加药物的情况下，以高糖（25 mmol/L葡萄糖）培养48 h，进行实验。随机分为6组（n=6）。Ⅰ组：正常对照组；Ⅱ组：高糖组；Ⅲ组：150 mg/L GL组；Ⅳ组：300 mg/L GL组；Ⅴ组：600 mg/L GL组；Ⅵ组：10 mg/L苯那普利组。所有实验细胞在体外扩增均不超过15代。
1.3 免疫组化检测MMP-2、TIMP-2蛋白的表达 将MCs以每孔2×1011/L接种于预先放入多聚赖氨酸处理过的无菌玻璃片的6 孔板内，每孔2 ml。各实验组药物刺激MCs 48 h后，取出玻片，PBS 洗3 次， 4%多聚甲醛4℃固定1 h，备用。按试剂盒说明书提供的步骤进行染色:固定好的细胞爬片，以3％过氧化氢溶液室温孵育15 min消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清室温封闭20 min， 滴加一抗， 4℃过夜， 37℃ 复温45 min ;滴加1∶100 稀释的生物素标记二抗， 37℃孵育30 min。以上每一步骤后用PBS 缓冲液振洗3 次， 每次5 min。滴加新鲜配制的DAB显色液，镜下控制显色、脱水、透明、封片。胞质含棕黄色物质者判断为阳性细胞。阴性对照用PBS 代替一抗。每张片随机计数5个不重叠视野， 每个视野选取2～4个细胞， 应用HPIAS-1000型医学彩色图像分析系统进行图像分析，得出阳性细胞表达的平均光密度(D值) ，代表阳性产物表达强弱， 将观察指标的表达强度转换为计量资料，留待统计分析。
1.4 RT-PCR检测MMP-2、TIMP-2 mRNA的表达 各组细胞实验结束弃培养基， PBS清洗细胞2次，采用大连宝生总RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA。各组总RNA 2 μg按RT-PCR试剂盒说明书，逆转录为cDNA后进行PCR。PCR反条件: 94℃预变性5 min，然后94℃变性40 s，52℃退火1 min，72℃ 1 min共35个热循环，最后72℃延伸10 min。取5 μl PCR 产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳，以β-actin为内参照，进行光密度定量分析，数值以MMP-2、TIMP-2与β-ctin的光密度比值表示mRNA表达的相对含量。凝胶电泳， 溴化乙锭（EB）染色后，凝胶成像系统半定量分析DNA含量。
引物自行设计并由大连宝生生物工程公司合成，引物序列为:β-actin：上游5′- CAG AAG GAC TCC TAC GTG(226～243) -3′，下游5′-GCT CGG TCA GGA TCT TCA TG (648 ～667) -3′，产物442 bp；MMP-2引物：上游5′-TTCCCCCGCAAGCCCAAGTG -3′(634～653)，下游5′-GAGAAAAGCGCAGCGGAGTGACG -3′(756～778)，产物145 bp；TIMP-2引物：上游5′-TGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC -3′ (400～420)，下游5′-TGCTGAAGAGGGGGCCGTGTAGAT- 3′(586～609)，产物210 bp。
1.5 统计学处理 计量资料用±s表示。应用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，实验组与对照组间的比较用单因素方差分析。P&<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 免疫组化检测MMP-2、TIMP-2蛋白的表达 MMP-2和TIMP-2在MCs中均为阳性表达，染色阳性部位在细胞质，呈棕黄色颗粒。150、300、600 mg/L GL和10 mg/L苯那普利刺激的大鼠MCs均有不同深浅的阳性表现。图像分析结果表明:高糖组（Ⅱ组）与正常对照组（Ⅰ组）相比， MMP-2蛋白的表达量显著降低(P&<0.01)， TIMP-2蛋白的表达量显著升高(P&<0.01);GL刺激大鼠MCs，当GL浓度为150～600 mg/L时（Ⅲ～Ⅴ组）， MMP-2蛋白的表达量逐渐升高， TIMP-2蛋白的表达量逐渐下降，与高糖组（Ⅱ组）有统计学差异(P&<0.05或0.01);在较高浓度的GL(600 mg/L)刺激下，MMP-2与TIMP-2蛋白相对表达量与苯那普利（Ⅵ组）及正常对照组（Ⅰ组）相比差异无显著性（P＞0.05）。见表1。 表1 MMP-2、TIMP-2在各组MCs中的表达与Ⅰ组比较：*P＜0.01；与Ⅱ组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与Ⅵ组比较：△P＜0.05
2.2 RT-PCR检测MMP-2、TIMP-2 mRNA的表达 MM0-2和TIMP-2 ｍRNA的RT-PCR产物电泳图见图1、2。图像分析结果表明:高糖组（Ⅱ组）与正常对照组（Ⅰ组）相比， MMP-2 mRNA的表达量显著降低(P＜0.01)， TIMP-2 mRNA的表达量显著升高(P＜0.01);GL刺激大鼠MCs，当GL浓度为 150～600 mg/L时（Ⅲ～Ⅴ组），MMP-2 mRNA的表达量逐渐升高， TIMP-2 mRNA的表达量逐渐下降，与高糖组有统计学差异(P＜0.01);在较高浓度的GL (600 mg/L)刺激下，MMP-2 mRNA与TIMP-2 mRNA表达量与苯那普利组（Ⅵ组）相比差异无显著性，并且与正常对照组（Ⅰ组）相比差异无显著性（P＞0.05）。见表２。表2 各组MCs中MMP-2、TIMP-2 mRNA 的表达与Ⅰ组比较：*P＜0.01；与Ⅱ组比较：▲P＜0.01；与Ⅵ组比较：△P＜0.05
DN 是DM微血管并发症之一，细胞外基质(extracellular matrix， ECM) 沉积是其主要的病理改变，ECM主要由Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等组成，ECM积聚和降解失衡是导致DN肾小球组织结构破坏乃至肾小球硬化的关键病理过程［3-4］。正常生理情况下， ECM的合成与降解处于一种动态平衡状态， DN时这种生理平衡被打破， ECM合成增加，降解减少［5-6］， 最终出现ECM积聚，导致纤维化的发生发展［7-8］。基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一组依赖二价金属阳离子的内肽酶，对细胞外基质有特异的降解作用，是肾脏内主要的基质降解体系，其表达量与活性的高低直接影响肾小球细胞外基质的表达量和局部沉积 。MMP-2 又称Ⅳ型胶原酶(明胶酶A) ，为MMPs 家族中重要的一员，其主要功能是降解ECM 成分中的Ⅳ型胶原，在肾脏主要由MCs分泌，在肾小球基底膜代谢过程中发挥重要作用［9］。激活后其降解基质的活性还会受基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的调节，TIMPs 可以高亲力与活化的MMPs 结合，抑制其活性。
MCs是DN 致病因子作用的主要靶细胞，研究它在体外高糖作用下以及GL干预治疗前后的生物学反应，对探讨GL治疗DN的机制具有重要意义。本实验以苯那普利作为阳性药物对照，通过体外干预高糖培养的MCs，观察GL对MCs MMP-2和TIMP-2表达的影响。结果表明，高糖能显著降低MMP-2的表达，提高TIMP-2的表达，与以往研究结果一致［10-11］。苯那普利能显著提高MMP-2的表达，抑制TIMP-2的表达，从而提高MMP-2/TIMP-2 比值，与马洪坡［12］等人所做的体内研究结果相似；而GL亦可显著提高MMP-2的表达，抑制TIMP-2的表达，从而提高MMP-2/TIMP-2 比值。本研究结果还显示，高浓度GL与苯那普利对MCs MMP-2和TIMP-2表达的影响相比无差异。
总之， 本研究以MCs为靶细胞，在细胞学水平上探讨GL对MCs表达MMP-2和TIMP-2的影响，目前国内尚无相关报道。结果表明，GL可显著提高系膜细胞MMP-2的表达，抑制TIMP-2的表达，从而提高MMP-2/TIMP-2 比值。本研究在体外证实GL通过调节MCs的MMP-2和 TIMP-2的活性与表达，对细胞外基质分泌均具有显著抑制作用，提示GL对DN的治疗可能具有一定的临床意义和应用前景。但有关GL对DN确切的肾保护机制尚有待于进一步深入研究。
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