【摘要】 目的 观察中草药GST-22对脑缺血/再灌注后海马神经细胞存活的影响。方法 采用四动脉阻塞（4-VO）大鼠全脑缺血模型，缺血前30 min以及缺血后1 h以30 mg/kg腹腔给药（GST-22），复灌5天，灌注取脑，石蜡切片，以焦油紫染色，图像分析测定单位面积内焦油紫染色细胞面积总和，组间比较，并进行形态学分析。结果 缺血前给药对脑缺血/再灌注后海马CA1区神经细胞有明显保护作用，约90%细胞存活；缺血后1 h腹腔给药对脑缺血/再灌注后海马CA1区神经细胞亦有明显保护作用，约有50%细胞存活（P&<0.05）。结论 中草药GST-22对脑缺血/再灌注后海马神经细胞有明显保护作用。
【关键词】 缺血 再灌注损伤 海 中草药 GST-22 神经保护作用 大鼠
Abstract:Objective To investigate the protective effects of GST-22 on the neuronal death induced by transient cerebral ischemia.Methods Transient (15 min) brain ischemia was induced by the four-vessel occlusion in Sprague-Dawley rats. The rats were given GST-22 30 mg/kg ip before or 1 h after ischemia. After 5 days of reperfusion， the rats were perfusion-fixed with paraformaldehyde， the brain sections were stained with crystle violet to examine the survival of CA1 pyramidal cells in the hippocampus.Results It was found that administration of GST-22 (30 mg/kg) could significantly decrease neuronal degeneration.Conclusions In view of the potent protective effect in cerebral ischemia， GST-22 can be a promising neuroprotective agent for stroke.
Key words： ischemia/reperfusion injury; hippocampus； traditional Chinese herbal medicine; GST-22; neuroprotective effect； rat
脑缺血性损伤是严重威胁人类健康的一类疾病，它的危害主要是可对中枢神经细胞产生不可逆性损伤，以海马CA1区迟发性神经元坏死（delayed neuronal death， DND）最为严重［1］。对脑缺血性损伤的治疗在我国多年来均有采用中草药治疗的病例，其疗效也得到一定程度的认同［2］。GST-22是一种新的中草药的提取物，那么它是否也对缺血性脑神经元的损伤有保护作用呢？本实验采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻塞（4-VO）大鼠全脑缺血模型，观察了脑缺血/再灌注中GST-22对海马CA1区细胞神经元损伤的保护作用。
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠，体重230～250 g，中国科学院上海实验动物中心提供(Ⅱ级，证书号005)。 GST-22为中草药提取物，为淡黄色粉末，易溶于二甲基亚砜（DMSO， Sigma）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备及动物分组 按Pulsinelli方法［3］进行。水合氯醛麻醉大鼠，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后用电凝针电凝双侧椎动脉。12 h后，大鼠清醒状态下，游离双侧颈总动脉，用动脉夹阻断血流，缺血15 min。在缺血时大鼠肛温维持在36.5℃～37.5℃。
SD大鼠随机分为5组：①Sham组，仅手术，不缺血；②I/R（ischemia/reperfusion， I/R）5d组，缺血后复灌；③I/R5d+DMSO组，即溶剂对照组，腹腔给相同剂量的DMSO；④I/R5d+pre-GST组，缺血前30 min按30 mg/kg腹腔给药（GST-22，溶于DMSD）；⑤I/R5d+post-GST组，缺血后1 h按30 mg/kg腹腔给GST-22。除Sham组外，其余4组缺血后复灌，5天。
1.2.2 取材及切片 术后5天存活的大鼠用水合氯醛麻醉，开胸灌注生理盐水200 ml，继之以4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB 配制，pH 7.4， 4℃)灌注，300 ml/30 min，取脑，4 %多聚甲醛后固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，片厚约5 μm 。
1.2.3 焦油紫染色 脑切片贴片后自然干燥、常规分色、脱水、透明、封固后镜检。双侧对应皮质区缺血病理变化不一致者，视为该模型一侧不完全缺血，予以淘汰， 其余切片保存备检。
1.2.4 形态学分析及细胞计数 普通光镜下观察，计数1 mm宽度海马CA1区内的存活细胞数。每组动物取6例计数。
1.3 统计学处理 数据以±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间数据比较采用新复极差法，P&<0.05为差异有统计学意义。
脑缺血15 min再灌注5天后，I/R5d组海马CA1区锥体细胞几乎完全消失，仅残留少数细胞；I/R5d+DMSO组与I/R5d组类似；I/R5d+pre-GST组，海马CA1区锥体细胞与Sham组比较，约有90%细胞存活（P&<0.05）；I/R5d+post-GST组，海马CA1区锥体细胞与Sham组比较，约有50%细胞存活（P&<0.05）。各组切片形态学变化见图1，细胞计数见表1。表1 各组海马CA1区1 mm宽度内活细胞计数与I/R5d+DMSO组比较：*P&<0.05
3 讨 论
近年来国内外研究表明， 脑缺血后除神经元坏死(necrosis)外还存在细胞凋亡， 脑缺血后的DND与细胞凋亡密切相关［4］。细胞凋亡主要是指有核细胞在一定生理或病理条件下， 通过启动内源性DNA内切酶的激活而发生由基因控制的细胞主动死亡过程， 与坏死在形态学、生物化学及分子生物机制等方面有本质区别［5］。对脑缺血的治疗主要集中在防止发生DND，从而减轻神经细胞的损伤，起到治疗作用。
GST-22作为一种新型中草药提取物，具有较高的纯度。本研究结果显示，实验大鼠腹腔给予GST-22能明显减轻大鼠全脑缺血/再灌注模型海马CA1区的神经细胞凋亡，对脑缺血所产生的神经细胞损伤从形态学上观察有较明显的保护作用；说明本药能够较好地透过血脑屏障，作用于脑神经细胞。
目前所研究治疗脑缺血的药物多数是于缺血前给药有明显的保护作用，而缺血后给药效果不理想。本实验中GST-22不仅在缺血前给药有显著的保护作用，在缺血后给药亦表现出较为明显的保护作用，此结果提示有临床用药可能。
目前，GST-22保护脑缺血神经细胞损伤的作用机制仍不清楚，有待进一步深入研究。
【参考文献】
［1］ Pei DS， Wang XT， Liu Y， et al. Neuroprotection against ischaemic brain injury by a GluR6-9c peptide containing the TAT protein transduction sequence ［J］. Brain， 2006， 129(Pt 2): 465-479.
［2］ Wang C， Zhang D， Li G， et al. Neuroprotective effects of safflor yellow B on brain ischemic injury ［J］. Exp Brain Res， 2007， 177(4):533-539.
［3］ Pulsinelli WA， Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat ［J］. Stroke，1979，10(3):267-272.
［4］ Nagata S. Apoptosis by death factor ［J］. Cell， 1997，88(3)：355-365.
［5］ Vaux DL. Toward an understanding of the molecular mechanisms of physiological cell death ［J］. Pro Natl Acad Sci USA， 1993， 90(3):786-789.
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