【关键词】 大鼠
摘要 :目的 探讨大鼠缺血再灌注肝一氧化氮合酶的变化及其意义。 方法 健康雄性SD大鼠24只，门静脉插管、肝静脉插管、胆道插管，切取肝，建立大鼠离体肝灌注（IPRL）模型。大鼠随机分为4组（每组6只）:①热缺血对照组，肝切取后，不作冷保存，立即进行灌注;②冷保存6h组，肝切取后作冷保存，保存6h后进行灌注;③冷保存12h组，肝切取后作冷保存，保存12h后进行灌注;④冷保存24h组，肝切取后作冷保存，保存24h后进行灌注。IPRL采用恒温灌注，经门静脉插管灌注pH7.4、38℃的Krebs-Bülbring buffer液30min。观察胆汁分泌，检测肝静脉流出液中白蛋白（ALB）含量，测定肝组织内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、ATP酶（ATPase）、超氧化物歧化酶（SOD）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）等指标。 结果 大鼠肝NOS发生了明显的变化，但肝组织NO、ET-1没有显著变化，ATPase、SOD、XOD、MDA的代偿也是有限的。再灌注过程中，各组大鼠肝均有胆汁分泌。肝静脉引流液中ALB含量无差异。 结论 NOS的变化是反映缺血再灌注损伤的敏感指标。
关键词 :大鼠;肝;缺血再灌注;一氧化氮合酶;酶
Abstract:Objective To study the level of nitric oxide synthase（NOS）in ischemia-reperfusion rat liver.Methods 24healthy male SD rats were anaesthetized and heparinised.The hepatic vein，portal vein and bile ductwere cannulated.The liver was then removed to establish a model of isolated perfusion rat liver（IPRL）.The rats were randomly pided into4groups（n=6per group）.In GroupⅠ（warm I.R group），the IPRL was formed immediately after removal.The livers of GroupsⅡtoⅣwere first stored in cold UW solution for6，12and24hours，respectively.The livers were then perfused via the portal vein，with freshly prepared Krebs-Bülbring buffer for30mins.The temperature of organ bath and perfusate was controlled at38℃.Bile secretion was noted;albumin（ALB）was determined.Histochemistry was performed to measure the activities of hepatic en-dothelin-1（ET-1），nitric oxide（NO），nitric oxide synthase（NOS），ATPase，superoxide dismutase（SOD），xanthine oxi-dase（XOD）and malondiaehyde（MDA）separately.Results The activity of NOSwas increased significantly as the period of cold storage wad prolonged（P&<0.05），no distinct changes were found in NO and ET-1，while slight variations were seen in AT-Pase，SOD，XOD and MDA.Bile was secreted during the ischemia-reperfusin process in all of the models.ALB showed no changes.Conclusion NOS is a sensitive index to reflect the liver ischmia.reperfusion injury.
Key words:rat;liver;ischemia.reperfusion（I.R）;nitric oxide synthase（NOS）;biocatalyst
一氧化氮合酶（NOS）是一氧化氮（NO）生成的限速酶，催化L-精氨酸生成瓜氨酸及NO。NO在许多生理系统和病理生理状态中起着细胞功能调节作用，在肝细胞蛋白质合成调节、肝中毒及肝硬化血流动力学紊乱等方面显示重要意义［1］ ，能够扩张肝血窦，增加肝微循环灌注。NO是性质活泼的气体小分子，在体内的半衰期仅有数秒，因此NOS是NO作用的关键因素［2］ 。内皮素（Endothelins-1，ET-1）和一氧化氮浓度的失衡是肝缺血再灌注损伤的重要原因［3］ ，了解缺血再灌注肝NOS的变化及其意义，有助于寻找改善肝微循环紊乱、减轻再灌注损伤的方法，有利于肝移植及复杂肝手术的开展。
1 材料和方法
1.1 动物与材料
1.1.1 实验动物与分组 健康雄性SD大鼠，体重250～300g，徐州医学院动物实验中心提供。SD大鼠24只，根据肝离体后是否冷保存及冷保存的时间分为4组，每组6只。①热缺血对照组（Ⅰ组）:肝切取后，不作冷保存，立即进行灌注;②冷保存6h组（Ⅱ组）:肝切取后作冷保存，保存6h后进行灌注;③冷保存12h组（Ⅲ组）:肝切取后作冷保存，保存12h后进行灌注;④冷保存24h组（Ⅳ组）:肝切取后作冷保存，保存24h后进行灌注。
1.1.2 主要试剂 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮合成酶（iNOS、eNOS）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、Na.K-ATP酶、Mg-ATP酶、Ca-ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。内皮素测试盒由解放军总医院东亚技术研究所提供。UW液（进口）购自美国施贵宝公司。
1.1.3 主要仪器 血管导管（PROTEX Limited.UK.）、HL-2D.HL-3B恒流泵及90-1型恒温磁力搅拌器（上海沪西分析仪器厂）、GC-911γ放射免疫计数仪（中国科技大学科技实业公司）、电热恒温水温箱（北京医疗设备厂）、TMS1024全自动生化分析仪（TOKYO BOKEI MEDICAL）、722S紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、BP61S电子天平（Sartorius AG Germany）、高速低温离心机（Heraeus.CO.Germa-ny）、SANYO SIM-F123制冰机（SANYO.CO.Janpen）、SANYO超低温冰箱（SANYO.CO.Janpen）
1.2 方法
1.2.1 大鼠肝切取和保存 术前不禁食，3%戊巴比妥钠30mg.kg腹腔注射麻醉，腹部“+”切口开腹。经下腔静脉注入25×10 3 U.L肝素生理盐水2ml，离断肝胃韧带、肝动脉等，进行胆道插管、门静脉插管。打开胸腔，游离肝静脉，进行肝静脉插管。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肝经门静脉灌注4℃生理盐水、UW液进行灌洗，然后置4℃UW液冷保存，保存结束后进行离体大鼠肝灌注。Ⅰ组肝用常温生理盐水灌洗，灌洗结束后立即进行离体大鼠肝灌注。肝灌洗压力0.1kPa， 速度10ml.min，肝灌洗至土黄色后连同部分膈一同切取（膈作为离体鼠肝灌注时悬吊使用）。
1.2.2 离体肝灌注 各组于预定时间进行离体大鼠肝灌注（isolated perfusion of rat liver，IPRL）。IPRL采用恒温灌注，即经门静脉插管灌注pH7.4、38℃的Krebs-Bülbring buffer液（KBB液，含133mmol.L NaCl、4.7mmol.L KCl、1.35mmol.L NaH 2 PO 4 、20mmol.LNaHCO 3 、0.61mmol.LMgSO 4 、7.8mmol.L Glu-cose、2.52mmol.L CaCl 2 ，英国伦敦大学St.Thomas’Hospital外科实验室提供）30min，门静脉灌注流量10ml.min。采用多孔针管充氧法将95%O 2 及5%CO 2 标准混合气体冲入（2～2.5L.min）KBB液进行氧合。
1.2.3 检测指标及方法
1.2.3.1 胆汁分泌 记录离体肝灌注过程中各组分泌胆汁的肝数目。
1.2.3.2 肝静脉流出液白蛋白（ALB） 取25～30min肝静脉流出液3ml，3000r.min，离心5min取上清液2ml，-20℃保存，测定前置于4℃环境溶解，溶解后自动生化分析仪测定。
1.2.3.3 组织生化指标 ET-1、NO、NOS及亚型、Na.K-ATP酶、Ca-ATP酶、Mg-ATP酶、SOD、XOD、MDA等。内皮素-1按照解放军总医院东亚技术研究所试剂盒的操作说明测定。其余各项组织生化指标均按照南京建成生物工程研究所试剂盒的操作说明测定。
1.3 统计学处理 数据以ˉx±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，冷保存各组与热缺血组比较采用t检验，冷保存各组间比较用方差分析，P&<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 胆汁分泌及肝静脉流出液中ALB含量 各组大鼠肝在离体灌注过程中都有胆汁分泌。肝静脉流出液中ALB含量无差异（表1）。
2.2 各组肝组织内皮素-1、NO含量 各组肝ET-1、NO含量未观察到明显差异（表1）。
2.3 各组肝组织NOS活力测定 各组NOS间存在差异，总体水平（T-NOS为e-NOS与i-NOS的总和）差异更明显。冷保存有利于NOS活性的保持，随着大鼠肝离体时间的延长，NOS活性发生代偿性改变（表2）。
2.4 各组肝组织Na.K-ATPase、Ca-ATPase、Mg-ATPase活力测定 各组大鼠肝Na.K-ATPase、Ca-ATPase、Mg-ATPase含量差异性不显著（表3）。
2.5 各组肝组织SOD、XOD、MDA含量 肝组织SOD、XOD、MDA含量有一定变化。冷保存有利于降低XOD含量，随着离体时间延长，SOD消耗呈增多趋势，剩余量减少（表4）。
表1 各组分泌胆汁肝数、肝静脉流出液ALB含量、肝组织ET-1及NO含量（略）
表2 肝组织NOS活力（略）
与Ⅰ组比较:*P&<0.05;与Ⅱ组比较:#P&<0.05;与Ⅲ组比较:△P&<0.05
表3 肝细胞ATPase活力（略）
表4 肝组织SOD、XOD、MDA活力含量（略）
与Ⅰ组比较:*P&<0.05;与Ⅱ组比较:#P&<0.05
3 讨论
NOS有2大类，原生型NOS（c-NOS）和诱生型NOS（i-NOS）。原生型NOS原本就存在于细胞中，其活性依赖Ca 2+ .CaM（钙调蛋白）的存在;诱生型NOS活性不依赖Ca 2+ .CaM，但需要脂多糖（LPS）及某些细胞因子等诱导因素的存在［4］ 。基因水平上原生型NOS又细分为神经元型（n-NOS）和内皮型NOS（e-NOS）2种，它们是不同基因编码的产物［5］ ，所以通常称NOS有3种。NOS在肝有诱生型和内皮型2种，n-NOS不参与肝缺血再灌注损伤的过程［6］ 。肝细胞、肝窦细胞（肝窦内皮细胞、Kupffer细胞、Pit细胞、肝星状细胞）均可通过L-精氨酸:NO通路释放NO。
经历了缺血再灌注，大鼠肝NOS发生了明显的变化（表2），但肝组织NO、ET-1没有显著变化（表1），各种ATPase、SOD、XOD、MDA的代偿也是有限的（表3、4）。再灌注过程中，各组大鼠肝均有胆汁分泌，说明离体以后各大鼠肝仍然保持了生理活性。肝静脉引流液中ALB含量无差异（表1），提示再灌注过程中NOS等指标的动态变化不是由于肝功能不同造成的，而是由于再灌注损伤不同造成的。Ⅰ组（热缺血组）肝离体时间最短，因此SOD消耗最少，含量最高，但是由于肝始终处于热缺血状态，能量代谢较高，所以产生的XOD、MDA较高。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肝离体时，迅速进入冷缺血状态，基础代谢低，因此XOD含量明显降低。
UW液被认为是迄今为止最有效的器官保存液，能显著减轻缺血再灌注损伤，延长肝离体保存时间，UW液的出现是20世纪80代末90年代初以来肝移植得到迅速推广的重要原因。既往大量实验及临床移植实践均已证实，UW液保存24h肝的功能与生理情况下肝功能基本接近［7～9］ 。本实验中肝离体达24h仍能分泌胆汁，而且各组肝静脉引流液中ALB含量无差异，主要是UW冷保存的优异效果所致。UW液能减轻缺血再灌注损伤，也造成NO、ET-1、ATPase、SOD、XOD、MDA等指标差异不显著（表1、3、4）。但与此同时，实验中大鼠肝NOS随着条件的不同而表现出较为显著的变化（表2），反映出不同情形下再灌注损伤间的差异，提示NOS变化是观察缺血再灌注损伤的敏感指标。
肝e-NOS的活性存在差异，主要是冷保存各组肝与热缺血肝间的差异，提示冷缺血处理有利于e-NOS活性的保存。从整体水平（T-NOS）观察NOS活性，不仅是冷保存各组肝与热缺血肝间有差异，而且Ⅳ组（冷保存24h）的含量也显著高于Ⅱ组（冷保存6h）、Ⅲ组（冷保存12h），反映随着离体时间的延长，缺血再灌注损伤逐渐加重引起的代偿性变化。同时也可以看出，T-NOS的增高是e-NOS和i-NOS共同增高的结果。
肝窦直径的生理调节由肝星状细胞控制，而肝星状细胞的收缩与舒张与ET和NO密切相关［10-11］ 。相关研究已经发现ET和NO浓度的失衡是肝缺血再灌注损伤的重要原因［3］ 。ET能收缩肝窦，调节肝窦的血流，它有3种异构体:ET-1、ET-2和ET-3，ET-1的缩血管作用最强，远大于ET-2和ET-3。NO具有多种生理调节功能，在肝主要是扩张肝窦，维持肝窦的低阻力状态。缺血缺氧情况下ET合成增加，肝内NO浓度降低［3，10］ 。ET浓度的增高导致微血管和肝窦收缩，肝血流减少，NO浓度的降低则进一步促进ET的缩血管效应，引起肝微循环功能障碍。在动物实验中，增大NO浓度及运用ET单克隆抗体能明显减轻肝的缺血再灌注损伤［3，12］ 。本实验中各组大鼠肝ET、NO含量间无差异，但NOS间有显著差异，提示添加底物L-精氨酸增加NO合成，有利于减轻ET和NO浓度的失衡，改善肝微循环功能障碍。
目前已有研究显示，添加外源性L-精氨酸有利于减低肝内血管阻力，改善肝微循环［13］ ，减轻缺血再灌注损伤［14］ ，提高肝移植成功率［15］ 。此外，研究也发现，i-NOS合成能力远大于e-NOS［2］ ，应激时i-NOS是NO合成增多的重要原因［16］ ，相关药物可以改变e-NOS、i-NOS的构成比。添加L-精氨酸的同时诱导i-NOS的高表达，可能也是改善肝微 循环的有效途径。
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