【关键词】 慢性乙型肝炎
摘要 :目的 探讨HLA-DRB1等位基因多态性与慢性乙型肝炎之间的关系。 方法 采用聚合酶链反应、反向特异性序列寡核苷酸探针（SSO）基因分型技术结合Luminex液态芯片技术对81例慢性乙型肝炎患者和90例正常人的HLA-DRB1等位基因进行分型比较。 结果 HLA-DRB1等位基因0901型在慢性乙型肝炎的等位基因频率明显高于对照组（33.33%、15.56%），两者相比差异有显著性（χ 2 =7.40，P&<0.01，RR=2.71），而HLA-DRB1等位基因0403型在慢性乙型肝炎的等位基因频率明显低于对照组（16.05%、35.56%），两者相比差异有显著性（χ 2 =8.37，P&<0.01，RR=0.37）;其他型别的等位基因2组间没有明显差别。 结论 HLA-DRB1等位基因0901型与慢性乙型肝炎易感性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的易感基因或连锁基因;HLA-DRB1等位基因0403型与慢性乙型肝炎抗性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的抗性基因。宿主的HLA-DRB1是乙肝病毒感染转归的重要因素。
关键词 :慢性乙型肝炎;HLA-DRB1基因;聚合酶链反应;反向特异性序列寡核苷酸探针;Luminex液态芯片技术;杂交
Abstract:Objective To investigate the association between chronic hepatitis B（CHB）and the polymorphism of HLA-DRB1.Methods The HLA-DRB1alleles in81patients with CHB and90normal control subjects were analyzed by using the polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide probes（PCR SSOP）technique and the Luminex liquid CMOS chip.Results The frequency of HLA-DRB10901allele in the CHB group was markedly higher than that in the normal control group（33.33%vs15.56%，with significant correlation between them，χ 2 =7.40，P&<0.01，RR=2.71）;the frequency of HLA-DRB1*0403in the CHB group was lower than that in the normal control group（16.05%vs35.56%，statistically sig-nificant，χ 2 =8.37，P&<0.01，RR=0.37）.No significant differences among the other alleles.Conclusion HLA-DRB10901is closely associated with the susceptibility to CHB，and may be the susceptible gene or linkage gene.HLA-DRB10403，in inverse proportion to the susceptibility to CHB，may be an oppositional gene.They two may regulate the outcome of the HBV infection in a victim.
Key words:chronic hepatitis B;HLA-DRB1gene;polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide probes（PCR SSOP）;hybridization
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染后可引起较广感染谱，有的人感染后成为无症状携带者或隐匿性肝炎，有的表现为急性肝炎经过，有的则迁延不愈成为慢性肝炎，甚至发生肝硬化或原发性肝癌［1］ ，这些不同的临床转归是病毒、环境和宿主遗传因素三者相互作用的结果［2-3］ 。许多研究表明，某些HLAⅡ类分子或等位基因与HBV感染的预后有密切关系［4-5］ 。苏北地区是乙肝高发区之一，在乙肝患者中进行HLA类型分析研究以探讨其对HBV感染转归的影响很有必要。我们采用聚合酶链反应（PCR）、反向特异性序列寡核苷酸探针（SSO）和Lu-minex液态芯片技术对慢性乙型肝炎患者HLA-DRB1基因多态性分析，初步探讨HLA-DRB1与淮安地区汉族人群HBV感染的相关性。现将结果报道如下。
1 资料和方法
1.1 研究对象
1.1.1 慢性乙型肝炎组 81例慢乙肝患者血液标本取自淮安市第四人民医院肝炎科住院及门诊患者;其中男65例，女16例，男女比为4.06;年龄17～70岁，平均35.8岁。诊断符合第10次全国传染病与寄生虫学术会议修订的诊断标准［6］ ，并且排除有其他肝炎病毒感染者。
1.1.2 对照组 90例对照血液样本来自淮安市血站本地汉族健康献血者，其中男55名，女35名，平均36.5岁（21～47岁）。
1.2 方法
1.2.1 外周血单个核细胞DNA提取 采用全血DNA抽提纯化试剂盒（Promega公司），血液标本经EDTA-Na 2 抗凝。严格按照试剂说明书操作。DNA提取后用紫外分光光度计检测DNA含量，A 260 .A 280 为1.65～2.0。DNA置-20℃冰箱保存。
1.2.2 PCR扩增 所需引物根据第13届国际组织相容性世界大会（IHWG）确定的HLA-DRB1基因核苷酸序列，设计出扩增DRB1片段的通用引物，在适宜的反应体系（HLA分型试剂盒含PCR反应液）中经TaqDNA聚合酶催化，扩增DRB1。PCR扩增产物加样至含溴乙啶的2%琼脂糖凝胶中电泳（图1）。用于PCR的模板DNA用灭菌双蒸水稀释，浓度大于20μg.L即可。
图1 PCR产物电泳结果（略）
M:Marker，S1 ～S 9 为PCR扩增样本
1.2.3 HLA-DRB1基因分型 采用快码HLA-SSO基因分型试剂盒（上海复旦张江医药股份有限公司）及相关分型软件。
分型原理:将扩增后的DNA产物与耦联在荧光编码微球（以下简称Beads）上的DNA探针进行杂交。Beads直径均为5.6μm，微球内部经2种不同的红色分类荧光染色，根据这2种染料混合比例不同，得到100种不同的颜色，Beads就有了100种不同的地址，Beads表面联有特异性寡核苷酸探针，探针经绿色荧光标记，由于Beads可标记为100种，则可联上100种不同的探针，扩增后的DNA产物与Beads上的DNA探针进行杂交，不同型别的DNA结合到不同的探针上去。由于Beads可在特定的溶液中悬浮，由Luminex研制的Luminex100分析仪能使Beads排成单列通过检测通道，并使用双色激光同时对Beads内的红色分类荧光和DNA探针上的绿色报告荧光进行检测。一束判定Beads的颜色来决定被测物的特异性（定性）;另一束测定Beads上DNA探针的荧光标记强度从而给被测物定量，将结果输入分型软件。
严格按试剂操作说明对扩增后的产物进行杂交、变性、中和、上机收集信号，分析结果。
1.3 统计学处理 基因频率的计算采用直接计数法，2组间等位基因分布的差异用四格表法进行χ 2 检验。相对危险性（RR）按Woolf公式计算:RR=ad.bc，a为携带某一特定型别的病例数，b为不携带某一特定型别的病例数，c为携带某一特定型别的对照组人数，d为不携带某一特定型别的对照组人数。
2 结果
慢性乙肝患者和正常对照者基因型比较见表1。
表1 慢性乙肝患者和正常对照者HLA-DRB1基因频率和相对危险性（略）
GF:基因频率;AF:等位基因频率;RR:相对危险性;N 1 、N 2 分别代表正常人和慢乙肝患者检出的阳性等位基因数;0101-0103:0101与0103本分型试剂不能区分，故作为一组统计，以下类似。
目前已经明确，HLA-Ⅱ抗原与多种疾病相关［7］ 。有关HLA-DRB1与HBV感染相关性的研究已在不同地区展开，并取得了一些进展，但是在不同地区人群中的研究结果并不一致:Hohler等［8］ 于1997年在高加索人群中研究发现，慢性乙肝的发生与HLA-DRB11301.1302型的表达呈负相关;Cotrina等 ［9］ 对慢性乙型肝炎和急性自限性乙型肝炎患者HLA-DRB1的基因型进行分析，进一步证实HLA-DRB11301/1302与清除HBV感染有关，对防止HBV感染后慢性化起保护作用。本研究得出的结论与贾宗剑等［10］ 在广州地区研究部分结果相同，他用改进的套式PCR-SSP方法对88名无血缘关系慢性乙肝患者和83名该地区健康对照者进行HLA分型，结果发现，HLA-DR9和DR14可能为慢性乙肝的易感基因，而DR4可能为慢性乙肝的抗性基因。
众多研究结果大多不同，究其原因，可能与感染HBV基因型不同，以及不同地区人群携带的HLA基因结构频率不同有关。由此可见，研究HBV感染和HLA-DRB1的相关性应当充分考虑到地区人群间的差异，即最好在同一地区人群中研究二者的相关性。
本课题以江苏淮安地区汉族人群为研究对象，通过预实验，着重探讨HLA-DRB1与该人群HBV感染的相关性。江苏省淮安地区汉族人群HLA-DRB1基因09型的携带率较高［11］ ，而本研究发现的HLA-DRB1等位基因0901型和0403型与淮安地区HBV感染相关（RR值分别为2.71和0.37），可能会成为解释江苏淮安地区汉族人群是乙肝病毒（HBV）感染的高发人群的重要原因之一。
本研究结果提示:HLA-DRB1等位基因0901型与慢性乙型肝炎易感性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的易感基因或连锁基因;HLA-DRB1等位基因0403型与慢性乙型肝炎抗性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的抗性基因。说明宿主的HLA-DRB1是乙肝病毒感染转归的重要因素。
参考文献
:［1］ Lee WM.Hepatitis B virus infection［J］.N Engl J Med，1997，337（24）:1733-1745.
［2］ Chu CJ，Lok AS.Clinical significance of hepatitis B virus genotypes［J］.Hepatology，2002，35（5）:1274-1276.
［3］ Thursz M.Genetic susceptibility in chronic viral hepatitis［J］.Antiviral Res，2001，52（2）:113-116.
［4］ Thio CL，Thomas DL，Karacki P，et al.Comprehensive analysis of classⅠand classⅡHLA antigens and chronic hepatitis B virus in-fection［J］.J Virol，2003，77（22）:12083-12087.
［5］ Ye-Gui Jiang，Yu-Ming Wang，Tong-Hua Liu，et al.Association between HLA classⅡgene and serity of thronic hepatitis B［J］.World J Gastroenterol，2004，12（3）:622-625.
［6］ Thio CL，Carrington M，Marti D，et al.ClassⅡHLA alleles and hepatitis B virus persistence in African Americans［J］.J Infect Dis，1999，179（4）:1004-1006.
［7］ 中华医学会传染病与寄生虫学会，肝病学分会.病毒性肝炎防治方案［J］.中华肝脏病杂志，2000，8（6）:324-329.
［8］ Hohler T，Gerken G，Notghi A，et al.HLA-DRB1*1301and*1302protect against chronic hepatitis B［J］.Hepatol，1997，26（3）:503-507.
［9］ Cotrina M，Buti M，Jardi R，et al.Study of HLA-Ⅱantigens in chronic bepatitis C and B in actute hepatitis B［J］.Gastroenterol Hepa-tol，1997，20（3）:115-118.
［10］ 贾宗剑，潘德京，付永贵，等.中国广州人群中HBV感染与HLA-DRB1基因相关性研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2002，22（1）:98.
［11］ 冯明亮，杨剑豪，季 芸，等.江浙沪汉族人群HLA-DRB1基因座遗传特征及不同人群频率分布比较［J］.中华医学遗传学杂志，2003，20（4）:365-367.