【关键词】 虎金颗粒剂
摘要：【目的】探讨虎金颗粒剂的最佳提取工艺路线。【方法】采用正交设计，以总大黄素、总蒽醌含量为醇提工艺指标，考察乙醇浓度、溶媒用量、提取时间等因素的最佳工艺条件；以总多糖含量为水提工艺指标，考察浸泡时间、水的用量、提取时间等因素的最佳工艺条件。【结果】醇提最佳工艺为：245*!mL体积分数为70%乙醇提取2*!h，共2次；水提最佳工艺为：80*!mL水，不用浸泡，提取15*!h，共3次。【结论】该提取工艺合理的，可行，为选择虎金颗粒剂的提取条件提供了实验依据。
关键词：虎金颗粒／分离和提纯；工艺学，制药；研究设计
虎金颗粒由虎杖、郁金等组成，经多年的临床疗效观察及动物实验研究证明，本方具有良好的抗脂肪肝及抗肝纤维化作用［１-５］。本文通过正交试验设计，对其提取工艺进行了实验研究，确定影响提取工艺的显著性因素。已有的研究表明，虎杖中的蒽醌类、郁金中的姜黄素等有效成分在乙醇中有较高溶解度，故这几味药材均采用乙醇提取；灵芝多糖具水溶性，故灵芝单独水提。结果如下。
1 仪器、药材与试剂
11 仪器
德国Sartorius电子天平；德国DIONEX P680A 高效液相色谱仪(HPLC)；德国DIONEX ASI-１００自动进样器；德国DIONEX PDA-100二极管阵列检测器；美国Agilent E8453紫外可见分光光度计；艾科浦ARUS-4-35G-2型台式超纯化水机。
12 药材与试剂
药材购于致信药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定；大黄素(emodin)(批号：0756-200211)、1，8二羟基蒽醌(批号：0829-9702)、无水葡萄糖(批号：0833-9501)均购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其余试剂为分析纯。
2 实验方法与结果
21 醇提工艺考察方法
以大黄素及总蒽醌含量为指标，按Ｌ９（３４）正交表进行实验，结果见表1。表1 醇提工艺各因素及水平设计（略）
211 总大黄素含量测定方法
2111 色谱条件
色谱柱：Chromasil C18，5μm，46*!mm×２５０*!mm；流动相：甲醇-016*!mol/L磷酸溶液(85∶１５）；柱温：25℃；流速：10*!mL/min。
2112 标准曲线制备
0204*!g/L的大黄素对照品溶液按1、4、8、12、16*!μL注入高效液相仪中，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程为y=52954x-01452，r=10，大黄素在0204～326*!μg范围内与峰面积呈线性相关。
2113 样品制备及测定
按表1设计提取的醇提液，定容至250*!mL，吸取25*!mL置于蒸发皿中，水浴蒸干；残渣用25*!mol/L硫酸25*!mL溶解后，按文献［６］方法处理，定容至50*!mL；吸取10*!mL氯仿液于蒸发皿中挥干溶剂，用甲醇定容至10*!mL，过滤后作为供试液；按8～15*!μL注入高效液相仪中，按外标二点法求得总大黄素含量。
212 总蒽醌含量(TA)测定
2121 最大吸收波长的确定
取适量标准品溶液、样品溶液及缺虎杖的阴性样品溶液，于400～800*!nm范围扫描，标准品溶液、样品溶液均在520*!nm处有最大吸收，阴性样品溶液在该处吸收度极低，无其他成分的干扰，故选定520*!nm为最大吸收波长。
122 标准曲线的制备
0108*!g/L的1，8二羟基蒽醌对照品溶液，按文献［６］方法处理，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程为y=4483x-003000，r=09995。对照品在4320～2160*!g/L范围内与吸光度呈线性相关。
2123 样品制备及测定方法
同2113项，定容至50*!mL，吸取5*!mL氯仿液于分液漏斗中，按文献［６］方法处理，定容至50*!mL作为供试液，于520*!nm处测其吸光度。
213 正交试验结果
见表2及表3。表2 醇提工艺正交试验及结果分析（略）表3 方差分析（略） 214 结果分析
经直观分析和方差分析可知，对该工艺影响的因素由大至小依次是Ａ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｂ，Ａ、Ｃ差异有显著性(Ｐ＜００５），B、D差异无显著性。结合生产实际情况，选定最佳提取工艺是Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ２，即用245*!mL体积分数为70%的乙醇，提取2*!h，提2次。
215 验证实验
按最佳工艺，用250倍处方量药材进行3次验证，大黄素含量分别是7987*!mg、8356*!mg、7868*!mg，RSD为316%；总蒽醌含量分别是10295*!mg、98084*!mg、9542*!mg，RSD为387%，含量均高于正交9次实验，且相对误差均小于5%，该条件下指标成分含量较稳定，因此该工艺是合理可行的。
22 灵芝提取工艺的考察
以总多糖含量为指标按Ｌ９（３４）正交表进行实验，结果见表4。表4 灵芝水提工艺各因素及水平设计（略）
221 总多糖(TP)含量测定方法
2211 最大吸收波长的确定
取适量显色后的对照品溶液、样品溶液，于400～800*!nm范围扫描，两者均在490*!nm处有最大吸收，故选定最大吸收波长为490*!nm。
2212 标准曲线制备
0492*!g/L的葡萄糖对照品溶液按文献［６］方法显色，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程为y=70056x-01405，r=09996，葡萄糖在0019 68～0118 1*!g/L范围内与吸光度呈线性相关。
2213 样品的制备及测定
按表4提取的水煎液，定容至250*!mL；吸取10*!mL于蒸发皿中水浴蒸干，用2*!mL蒸馏水溶解，加入18*!mL无水乙醇，使含醇量达90%，以3000*!r/min离心5*!min，弃上清液，沉淀后用蒸馏水溶解定容至25*!mL，吸取1*!mL样品液，按文献［７］方法处理后，检测其吸光度，求出总多糖含量。
222 总多糖(TP)含量测定结果
见表5及表6。表5 水提工艺正交试验及结果分析（略）表6 方差分析（略
223 结果分析
经直观分析和方差分析可知：因素C、D差异有显著性(P＜005)，因素A、B差异无显著性。结合生产实际情况，选定最佳提取条件为Ａ１Ｂ１Ｃ３Ｄ３，即不用浸泡，用80*!mL水煎煮15*!h，煮3次。
224 验证试验
按最佳工艺，用250倍处方量药材进行3次验证，总多糖含量分别是31015*!mg、32440*!mg、30379*!mg，RSD为337%，含量均高于正交9次实验，且相对误差值小于5%，该条件提取的灵芝多糖含量较稳定，因此，该提取工艺是合理可行的。
3 讨论
大黄素除了有保肝利胆退黄的作用外，还有抗肝纤维化的作用［７］。其化学性质稳定，有比较成熟的含量测定方法，本实验采用HPLC法测定其含量，较之薄层扫描法、毛细管电泳法结果更为准确、可靠。虎杖中既有游离型又有结合型大黄素，在生物体内，结合型苷类会被水解成苷元，因此，以水解后总大黄素含量作为评价工艺的指标比单用游离型或结合型更为合理。虎杖的主要活性化学成分除了大黄素外，还有大黄酚、大黄酸等其他蒽醌类成分，这些成分均有抗菌、抗炎、保肝等生理活性，在520*!nm处无其他成分的干扰，运用分光光度法测定总蒽醌含量，简便而准确，因此选择蒽醌为另一检测指标是合理可行的。单一成分作为质控指标存在局限性，以多指标评价和控制提取工艺的质量，更为全面、科学。
参考文献
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