【摘要】 目的 探讨睡眠剥夺(sleep deprivation，SD) 对大鼠神经内分泌功能变化的影响。方法 将60只Wistar雄性大鼠随机分为6组(每组10只)：空白对照组（C组）、 AS对照组(AS组)、ASSD1天组（SD1d组）、ASSD3天组（SD3d组）、ASSD5天组（SD5d组）、ASSD7天组（SD7d组）。5组建立AS模型后，其中4组再建立，SD模型，分析各组大鼠心电图变化、生理及行为改变，测定各组大鼠血清中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）及皮质醇（cortisol，CORT）的含量。结果 SD后AS大鼠精神状态逐渐转差，反应变迟钝、变虚弱，随着SD时间的延长，AS大鼠呈先兴奋，然后激惹，最后衰竭的变化趋势。随着SD的时间延长，AS大鼠心率呈先增快后减慢的波动性变化。心电图ST-T逐渐上抬，T波高耸直立。ACTH及CORT水平呈先增高后下降的波动性变化。结论 SD造成的应激性刺激，能够激活HPA轴，从而引起AS大鼠神经内分泌功能发生变化。
【关键词】 睡眠剥夺 动脉粥样硬化 神经内分泌
【Abstract】 Objective To observed the fluctuations of the changes of neuroendocrine function in atherosclerotic rats after sleep deprivation. Methods 60 Wistar male rats were randomly pided into 6 groups（10 each）: The control group、AS group、SD1d group、SD3d group、SD5d group and SD7d group. After 5 groups were established AS model， 4 groups were established sleep deprivation model. Observed the physiological and behavioral changes in AS rats ， observed their electrocardiogram performance and tested content of ACTH and CORT in serum in AS rats after SD. Results The mental state of AS rats was gradually deteriorated， response dull， variable weak， With the time of SD， AS rats was first excited， then irritated， at the last failure. The changes of heart rates of AS rats in volatility of fast at first then slow down with the time of SD. With the time of SD， ST-T of electrocardiogram elevated gradually， T wave tall and upright. The levels of ACTH and CORT in AS rats were in the volatility of changes after SD. Witch is increased at first and then declined. Conclusion: Stress stimulation caused by SD can activate the HPA axis so that it can influence to the changes of neuroendocrine function in atherosclerotic rats.
睡眠剥夺(sleep deprivation，SD) 具体指人因环境或自身原因丧失了所需要睡眠量的一种过程和状态。SD影响了机体固有的生物节律，使机体处于应激状态。本研究以神经内分泌系统所产生的促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）及皮质醇（cortisol，CORT）为切入点，通过测定其在大鼠血清中的表达量在不同SD时间情况下的波动情况，分析各组大鼠神经内分泌功能状态，并结合各组大鼠心电图变化、生理及行为改变来反映SD对大鼠神经内分泌功能变化的影响。
1材料与方法
1.1分组
60只Wistar雄性大鼠（由中山大学动物实验中心提供），体重（250±10
）g。随机分为6组：空白对照组（C组）10只、大平台对照组（A组）10只、ASSD1d组（SD1d组）10只、ASSD组3d组（SD3d组）10只、ASSD5d组（SD5d组）10只、ASSD7d组（SD7d组）10只。
1.2 建立大鼠AS 模型
参照文献[1] 方法，50只大鼠在腹腔注射维生素D3 (60 万u/ kg) 后，给予高脂饲料（3 %胆固醇，0. 5 %胆酸钠，0. 2 %丙基硫氧嘧啶，5 %白糖，10 %猪油，81. 3 %基本饲料） 喂养8周可形成典型的AS 病变。
1.3 建立AS大鼠睡眠剥夺模型
以“改良多平台水环境SD法”制备SD模型[2]。将4组大鼠，每组各放在一个装有15个小平台的水槽中饲养（主要是利用大鼠怕水及在水中无法进入睡眠的生活习性，通过在盛水的水槽中放置平台，让大鼠站立在平台上，大鼠在平台上可自由进食饮水，并可在平台间自由活动。因平台直径足够小（直径6.5cm)，若其睡眠，会因全身肌张力降低引起节律性低头、触水或落入水中惊醒，来达到SD的目的），以此建立起ASSD模型。SD1d组为持续SD1天，SD3d组为持续SD3天，SD5d组为持续SD5天，SD7d组为持续SD7天。为排除隔离及水环境造成的影响，将A组10只大鼠放置在大平台上饲养，采用与SD组大小一样的水箱，但在其底部放置的平台大小为30cm×18cm×8cm，大鼠在平台上有一定活动空间，可以自由睡眠，用以形成与SD各组相似的环境，其他环境与实验组相同。C组采用正常笼养，自然昼夜光照，喂基础饲料。实验前1周将实验所需大鼠放至一只笼中饲养，熟悉适应环境1周。
1.4 观察各组大鼠生理及行为改变
观察各组大鼠的精神状态、反应能力以及行为表现的变化。
1.5 各组大鼠心电图监测
将大鼠用20%乌拉坦0.8ml/kg注射麻醉，约5min待大鼠安静后，在小动物实验台上仰卧固定大鼠。接通RM-6000多通道生理仪电源，打开机器，将针电极（注射器针头连于电极）分别向心刺入大鼠四肢皮下，电极连线分为红色（R）右上肢、黄色（L）左上肢、黑色（RF）右下肢、绿色（LF）左下肢。描记标准导联II导联体表心电图并进行分析，记录心率及ST段位移值。描记条件为：标准电压：为20mm/mV，描记速度为50mm/s。通过观察心电图ST位移值（ST段位移值变化以QRS波群起点连线为基线，测量点取J点后0.02s）可反映心肌缺血程度。心电图形及间期测量方法按徐叔云等[3]方法进行。
1.6 各组大鼠血清ACTH及CORT含量测定
各组大鼠在相应时间点用10%水合氯醛（0.3 m1/100 g体质量）大鼠腹腔注射麻醉，用毛细玻管眶内静脉取血2 ml， EDTA抗凝，静置0.5 h后4℃，3 000 r/min离心10 min，取血浆1 ml，保存在-70℃的冰箱中，以备待测ACTH和CORT的含量。用放射免疫分析法统一测定ACTH和CORT含量，按试剂盒说明书进行操作。ACTH及CORT试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.7 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件，计数资料以 _ X±s表示，组间均数比较采用完全随机设计单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 各组大鼠生理及行为改变 SD后大鼠精神状态逐渐转差，反应变迟钝，食欲不振，身体渐消瘦、变虚弱，皮毛变粗糙、蓬乱而没有光泽。SD初期，大鼠精神亢奋，对声音、气味、光线等刺激的反应较敏捷。行为兴奋性提高，较为活跃。到SD第3天时，SD3d组中所有大鼠出现磕睡、节律性垂头现象，并常因鼻子浸入水中或掉入水中而惊醒。到SD第5天时，SD5d组中所有大鼠表现烦躁、易怒、相互之间喜撕咬、打斗。至SD第7天时，SD7d组中所有大鼠均表现为呼吸加快，精神萎靡，而对声音、气味、光线等刺激的敏感性下降。低头驼背，蜷缩颤抖，不喜动，活动能力明显减退。进食少，身体极度虚弱。
2.2 各组大鼠心率变化
SD后大鼠心率变化较大。SD刚开始时大鼠心率先是极度增快，于SD1d时心率最快达到最高值，与SD5d组及SD7d组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.001）。随着SD时间的延长，心率逐渐减慢。（见表1，图1-6）
表1 各组大鼠心率变化（ _ X±s）
与C组比较，a p＜0.01；与AS组比较，b p＜0.01；与 SD1d组比较，c p＜0.01；与SD3d组比较，d p＜0.01；与SD5d组比较，e p＜0.01。
2.3 各组大鼠心电图ST-T改变
C组大鼠心电图ST-T改变与SD3d组、SD5d组及SD7d组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。A组与SD5d组及SD7d组比较，均有显著性差异（P＜0.001）。SD1d组与SD5d组及SD7d组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。SD3d组与SD5d组及SD7d组间两两比较，均有显著性差异（P＜0.001）。随着SD的时间延长，大鼠心电图ST-T逐渐上抬，T波高耸直立。（见表2，图1-6）
表2 各组大鼠心电图ST-T改变（ _ X±s）
2.4 大鼠血清ACTH含量变化
C组、A组、SD1d组三组之间相互两两比较无显著性差异（P＞0.05）。该三组分别与SD3d组、SD5d组、SD7d组间相互两两比较差异均有显著性（P＜0.001）。随着SD时间的延长，大鼠血清ACTH含量，先呈现升高的趋势，并在SD3d时大鼠血清ACTH含量达到最高值，与SD5d组、SD7d组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）。之后大鼠血清ACTH含量呈明显的下降趋势，至SD7d时，其ACTH含量最低，与SD5d组比较差异具有统计学意义（P＜0.001）。（见表3）
表3 各组大鼠血清ACTH含量变化（ _ X±s）
与C组比较， a p＜0.01；与AS组比较，b p＜0.01；与 SD1d组比较，c p＜0.05，d p＜0.01；与SD3d组比较，e p＜0.01；与SD5d组比较，f p＜0.01。
2.5 大鼠血清CORT含量变化
C组、A组、SD1d组、SD3d组、SD5d组及SD7d组间相互两两比较，均有显著性差异（P＜0.05）。随着SD时间的延长，大鼠血清CORT含量先呈逐渐升高趋势，至SD5d时达到最高值，CORT含量约为C组的2倍，之后降低。(见表4）
表4 各组大鼠血清CORT含量变化（ _ X±s）
与C组比较，a p＜0.01；与A组比较， b p＜0.01；与 SD1d组比较，c p＜0.05，d p＜0.01；与SD3d组比较，e p＜0.01；与SD5d组比较，f p＜0.01。
SD影响了机体固有的生物节律，使机体处于应激状态。既往国内外专家研究显示：应激对机体的影响主要通过下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）和交感-肾上腺髓质系统的调节实现的。一般来说，应激所引起的反应对机体是积极有利的，它可以增强机体的适应能力，然而过度应激超出了适应机制的调节范围，将耗竭机体的抵抗能力，机体内环境明显失衡，就会可能引发应激紊乱导致疾病的发生发展甚至生命的终结。机体受到强烈刺激时，应激反应进而诱发机体产生一系列相应的行为和生理适应反应。这些行为变化主要有：警觉和警惕性提高，注意力集中和应变能力增强，欣快或沮丧，以及植物神经功能如食欲、摄食等的抑制。生理改变体现血压升高、心跳和呼吸均加快。相反，生长及生殖等方面受抑制[4]。本研究发现，SD后从大鼠生理及行为的改变来看，提示SD作为一种强烈的应激原，可对机体造成多方面的影响，如生理功能及精神、情绪、行为方面发生改变，这与既往文献报道一致[5]。
本研究从大鼠心率变化表现探寻SD情况下发生心律失常的原因：SD影响了机体固有的生物节律，使机体处于应激状态，在SD初期，机体神经内分泌功能异常，交感神经兴奋，大量儿茶酚胺及糖皮质激素释放，引起心率加快。而随着SD时间的延长，机体内环境明显失衡，自主神经功能紊乱，心率随之逐渐减慢。
本研究从各组大鼠心电图ST-T改变究其原因为：在SD应激条件下，持久的交感神经兴奋，大量儿茶酚胺及糖皮质激素释放，血循环中的血小板数目增多，粘附聚集性增强，而白细胞及纤维蛋白原浓度增高[6]，血液粘滞度和血栓形成的风险增高。同时心肌耗氧量增大，冠状动脉强烈收缩。以上几种因素均引起心肌缺血。
ACTH是腺垂体分泌的一种激素，因其可促进糖皮质激素的合成和分泌而得名。其最主要的生理作用是促进肾上腺皮质的生长和刺激类固醇生成[7]。
CORT（大鼠为皮质酮）是由肾上腺分泌的应激激素，对糖代谢具有强烈调控作用，因而也被称为糖皮质激素。CORT是HPA轴的终末产物，对机体的糖、脂肪和蛋白质的代谢有重要影响，因此常作为研究应激的最经典、最重要的指标之一。
本研究发现，随着SD时间的延长，大鼠血清ACTH及CORT含量呈现先增高后下降的波动性变化。探讨其原因，考虑在SD状态下，大鼠受到SD应激刺激后，HPA轴激活，刺激脑干上行网状激动系统，诱导下丘脑产生兴奋，并通过分泌促肾上腺皮质激素释放激素，作用于肾上腺皮质激素细胞的膜受体，调节ACTH的释放和生物合成，ACTH随血液到达肾上腺皮质，下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素作用于垂体的ACTH含量的增加最终导致了肾上腺CORT的升高，进而导致机体整体处于高水平的CORT中。有研究认为[8]这是因为在应激状态下，机体出现垂体-肾上腺轴功能增强，从而引起ACTH及CORT浓度反应性升高，这时机体出现保护防御性的快速动员并处于最佳状态。但随着SD时间的延长，持续强烈的有害刺激将耗竭机体的抵抗能力，就会导致某些神经内分泌器官的损伤及功能低下（如肾上腺皮质功能减退），使得ACTH、CORT含量变化的趋势出现从原来的升高，到后来的下降的波动性变化趋势，并可能由此引发应激紊乱[9-11]，出现应激相关的疾病、器官功能衰退。
综合本研究结果及国内外相关报道，从SD引发神经内分泌系统改变的规律及总体变化趋势来看，本研究证明SD造成的应激性刺激，能够激活HPA轴，并刺激ACTH及CORT分泌，且随着SD时间的变化，激素分泌水平发生波动，并反馈性地引起应激水平的变化。从而对心血管系统产生影响。
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