作者：潘乐玉 滕木俭 时昌文 王明海
【摘要】 目的： 探讨RhoC及基质金属蛋白酶-９（metrix metalloproteinases， MMP-9）蛋白在原发性肝细胞肝癌（以下称肝癌）发生、发展、转移及术后复发过程中的作用。方法：采用免疫组织化学染色检测43例肝癌患者术后癌灶和癌周标本及25例肝硬化、23例正常肝脏标本中两种蛋白的表达情况，分析两种蛋白的表达与肝癌病理特点的关系及两者表达的相关性，采用COX比例风险模型进行肝癌术后复发风险多因素分析。结果：RhoC在肝癌组与癌旁组、肝硬化组、正常肝组及癌旁组与正常肝组表达程度差异有统计学意义（P<0.05）；MMP-9在肝癌组与癌旁组、肝硬化组、正常肝组表达程度差异有统计学意义（P<0.05）。RhoC与MMP-9在肝癌癌灶中表达存在相关性，且为正相关（rs'=0.495， P<0.01）。RhoC阴性组的中位生存时间46个月，阳性组中位生存时间为20个月；MMP-9阴性组的中位生存时间49个月，阳性组的中位生存时间25个月； RhoC及MMP-9都为阴性，中位生存时间56个月；RhoC或MMP-9为阴性，中位生存时间39个月；RhoC及MMP-9都为阳性，中位生存时间19个月。COX比例风险分析模型分析认为：肿瘤侵及门静脉（包括微转移灶）、淋巴结转移、RhoC及MMP-9阳性表达分别为肿瘤术后复发的独立危险因素。结论：RhoC蛋白在肝癌的早期开始起作用，且RhoC蛋白及MMP-9蛋白的异常高表达提示肿瘤恶性程度高，术后复发率高，指导临床术后预防性化学治疗有一定指导意义。
【关键词】 癌，肝细胞·RhoC蛋白·基质金属蛋白酶类·复发
【ABSTRACT】 Objective: To explore the value of ras homologous C （RhoC) and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9) protein in the occurrence， development， metastasis and recurrence of primary hepatocellular carcinoma （HCC). Methods: To investigate the expression of the two proteins in the specimans of 43 HCC， 43 paracancer， 25 cirrhosis and 23 normal liver tissues by immunohistochemistry， and analyse the relation between the expression and the pathologic features of HCC and the expression among the different tissues， including the correlation between the two proteins. COX proportion hazard model was used to estimate the recurrence risk factors. Results: The expression of RhoC protein in specimans of HCC was significantly higher than paracancer， cirrhosis and normal liver tissues， the difference between paracancer and normal liver tissues was also significant. The expression of MMP-9 protein in specimens of HHC was significantly higher than paracancer， cirrhosis and normal liver tissues. There was positive correlation between the expressions of the two proteins. （rs=0.495 P<0.01) .The median survival time in negative group of RhoC protein was 46.00 months and the positive one was 20.00 months. The median survival time in negative one of MMP-9 protein was 49.00 months and the positive one was 25.00 months. The median survival time in conegative group of RhoC and MMP-9 protein was 56.00 months， the median survival time of single negative group of RhoC or MMP-9 protein was 39.00 months， the median survival time in copositive group of RhoC and MMP-9 protein was 19.00 months. The COX proportion hazard model revealed that portal vein invasion， lymph node metastasis and expression of RhoC and MMP-9 protein were the independent recurrence risk factors. Conclusion: RhoC protein played a role at the early stage of the HCC， and the expression of RhoC and MMP-9 protein in HCC tissue was closely correlation to the recurrence after hepatectomy， which could induct the chemoprophylaxis.
【KEY WORDS】 Carcinoma， hepatocellar·RhoC protein·Metrix metalloproteinases·Recurrence
肝细胞癌（以下简称肝癌）是全球常见的恶性肿瘤之一，也是我国第2位的肿瘤死亡原因［１］。肝癌高死亡率的原因在于早期易发生肝内转移，侵及肝内管道及手术切除癌灶后高复发［２］。RhoC及基质金属蛋白酶-9（metrix metalloproteinases， MMP-9）的表达失调可能是肝癌早期转移及术后复发的重要原因［３］。本研究采用免疫组织化学检测RhoC蛋白及MMP-9蛋白在肝癌、癌周、肝硬化及正常肝组织标本的表达情况，探讨两种蛋白表达的相关性及两种蛋白在肝癌发生、发展、转移及侵袭中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 肝癌及癌周组织来源于山东大学附属千佛山医院2000年3月—2002年3月的手术切除标本，术后均经病理组织学检查确诊，肝硬化组织来自此院同期门静脉高压症手术肝活组织检查患者，正常肝组织为此院同期血管瘤瘤旁正常组织及肝移植供体肝。其中肝癌组（同癌旁组）43例，男29例，女14例；年龄32～73岁，中位年龄44岁。肝硬化组25例，男18例，女7例；年龄29～65岁，中位年龄36岁。正常肝组织23例，男16例，女7例，年龄27～50岁，中位年龄35岁。
1.2 方法
1.2.1 标本收集处理 标本组织离体后，10%甲醛固定。取癌灶组织避开癌灶中心坏死组织，癌旁组织距离癌灶>2 cm。所用肿瘤标本均行常规病理组织学检查并分类。
1.2.2 材料 抗RhoC多克隆抗体（sc-12116 Santa Cruz 美国)；抗MMP-9单克隆抗体、PV-6001免疫组织化学试剂盒、DAB试剂盒（中杉金桥生物工程有限公司，北京)。PBS溶液、枸橼酸盐缓冲液、医用梯度乙醇、二甲苯、中性树胶等均由山东省千佛山医院普外中心实验室提供。
1.2.3 免疫组织化学染色 组织5 μm厚连续切片，脱蜡、水化、微波抗原修复。作用10 min后，加RhoC及MMP-9蛋白抗体，按二步法步骤进行，DAB显色，苏木精复染。以PBS代替一抗作阴性对照，分别以已知RhoC、MMP-9蛋白阳性的组织切片作阳性对照。
1.2.4 结果判定 以细胞质内出现棕黄或棕褐色颗粒作为阳性标准。按Shimizu免疫组织化学评分标准：在高倍镜下，染色强度浅着色为1分，中度着色为2分，深度着色为3分；阳性面积无着色者为0分，着色面积<1／3为1分，1／3～2／3为2分，>2／3为3分。两者相加为综合染色强度评分，0分判为阴性“-”，1～2分判为弱阳性“+”，3～4分判为阳性“++”，5～6分判为强阳性“+++”。
1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件进行分析，计数资料比较用秩和检验，相关性分析采用等级相关分析；组间无瘤生存率比较采用Log-rank法。采用 COX回归多因素模型对复发相关因素进行多因素预后分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RhoC蛋白的表达 RhoC蛋白表达在细胞质（图1 A），在肝癌组与癌旁组、肝硬化组、正常肝组及癌旁组与正常组表达差异有统计学意义（P<0.05，表1、2），而癌旁组与肝硬化组、肝硬化组与正常组差异无统计学意义（P>0.05，采用Nemenyi法检验，见表1、2）。
2.2 MMP-9蛋白的表达 MMP-9蛋白亦表达在细胞质（图1 B），在肝癌组与癌旁组、肝硬化组、正常组表达程度差异有统计学意义（P<0.05，表1、2）；而癌旁组与肝硬化、正常组及硬化组与正常组差异无统计学意义（P>0.05见，表1、2）。
2.3 RhoC与MMP-9在癌灶表达相关性分析 RhoC与MMP-9在癌灶表达相关性，采用Spearman等级相关分析，等级相关系数rs′=0.495， P<0.01，表明RhoC与MMP-9在肝癌癌灶中表达存在相关性，且为正相关（表3）。
将RhoC及MMP-9分别分为阳性组及阴性组（“-”、“+”为阴性组，“++”、“+++”为阳性组），以肿瘤复发为终点事件进行生存分析（Kaplan-Meier法）， 组间无瘤生存率比较采用Log-rank法。RhoC阴性组的中位生存时间46个月，95%可信区间为[34.75，57.25]，阳性组中位生存时间为20个月，95%可信区间为[9.20，30.80]，生存曲线见图2；MMP-9阴性组的中位生存时间49个月，95%可信区间为[38.43，59.57]，阳性组的中位生存时间25个月，95%可信区间为[15.34，34.66]，生存曲线见图3。按照RhoC及MMP-9表达情况不同，分为3组：RhoC及MMP-9都为阴性（A组）；RhoC或MMP-9为阴性（B组）；RhoC及MMP-9都为阳性（C组）进行生存分析。A组：中位生存时间56.00个月，95%可信区间为[26.78，85.22]；B组：中位生存时间39个月，95%可信区间为[25.75，52.25]；C组：中位生存时间19个月，95%可信区间为[14.73，23.27]。生存曲线见图４。肿瘤侵及门静脉（包括微转移灶）、淋巴结转移、RhoC及MMP-9蛋白阳性表达是肿瘤术后复发的独立危险因素（表4）。
3 讨论
Rho家族属于小分子G结合蛋白的Ras超家族。Rho家族蛋白与GDP结合形式游离于细胞质中，与GTP结合形式则作用于细胞内的效应因子。RhoC是Rho基因家族的一个成员，参与细胞信号转导、增殖和肌动蛋白骨架的调节，在肿瘤细胞的游走过程中，RhoC起着关键的作用［4］。本研究中，RhoC在癌灶组的表达程度高于癌周组、肝硬化组及正常肝组，同时癌周组的表达高于正常肝组，说明RhoC的表达在肝癌的发展过程中呈逐渐增强的趋势，提示RhoC在肝癌的早期及演进过程中有一定的作用。本研究显示RhoC在肝硬化组及正常肝组的表达差异无统计学意义，但是这两组样本合并后，按照乙型肝炎抗原阳性重新分组，分析RhoC的表达情况，表明在肝硬化组及正常肝组RhoC的表达与乙型肝炎表面抗原阳性相关，这与郑岩松等［5］的研究结果一致。对RhoC阳性的患者随访5年，结果除2例肝硬化患者死于上消化道出血外，无患者发生肝癌。推断可能原因：1）虽然 RhoC在原发性肝癌的早期阶段有一定的作用，但是RhoC不是肝癌的诱因或起始因素。2）由于肝硬化样本都是取自肝硬化引起门静脉高压行断流手术的患者，样本存在偏性，因为上消化道出血的患者都呈肝脏重度硬化，肝功能严重失代偿，有可能未发展到肝癌而死于肝功能衰竭、上消化道出血等并发症。3）肝癌是多种因素作用、长期发展的最终结果，其发病率约为10人/10万人，本研究随访时间不够，样本太少可能影响统计结果。对43例肝癌患者术后随访5年，结果显示RhoC阳性组复发率明显高于阴性组，进一步提示RhoC表达程度与肿瘤的恶性程度呈正相关。
细胞外基质和血管基膜的降解与肿瘤侵袭转移密切相关［6］。MMPs能够降解基膜蛋白以及细胞外基质的所有成分，MMP-9是其中重要的一员，其最主要的功能是溶解、破坏细胞外基质中最主要的Ⅰ型胶原和明胶［7］。本研究显示，肿瘤癌灶MMP-9的表达明显高于癌周、肝硬化组及正常肝组；门静脉侵犯及淋巴结转移的病例标本中，MMP-9的表达明显高于阴性的病例，提示MMP-9可降解细胞外基质及门静脉血管基膜或毛细淋巴管，促进肿瘤细胞进入管道，引起周围肝组织或淋巴结的转移。在癌灶无包膜，呈浸润性生长的病例中，MMP-9同样高表达，促进肿瘤细胞对周围组织的浸润，也证实了MMP-9的表达强度与肿瘤的恶性程度呈正相关。另外本研究发现，MMP-9表达阳性的病例复发率明显高于阴性的病例，提示MMP-9基因表达水平可以作为原发性肝癌复发、侵袭和转移的指标，有助于筛选复发、转移的高危对象，并及时采取综合措施来控制肝癌转移、复发。Arii等［8］也得到相似的结论。
本研究发现，RhoC、MMP-9的表达程度呈正相关，RhoC、MMP-9均阳性的病例5年内复发率高于RhoC或MMP-9及RhoC和MMP-9均阴性的病例。侵及门静脉（包括微转移灶）、淋巴结转移、RhoC及MMP-9蛋白阳性表达是肿瘤术后复发的独立危险因素。本研究认为，肿瘤在发生、发展的过程中，MMP-9蛋白表达增高，降解细胞外基质及血管、淋巴管及胆管管道的基底膜；同时高表达RhoC促进细胞在细胞基质中游走，突破基底膜屏障进入血管、淋巴管及胆管是原发性肝癌发生肝内播散、淋巴结转移及远处转移形成微转移灶，成为原发灶切除后残留的“种子”，为术后高复发率的重要原因。
化学治疗药物除了能够具杀伤肿瘤细胞还有多方面的副作用，临床上使用往往要评价二者关系，权衡利弊。肝癌细胞对目前大多数化学治疗药物敏感性差，因此对肝癌术后是否采用预防性化学治疗，存在较大的争议［9］。争论点在于：化疗药物的副作用严重影响了机体免疫系统，实际上促进了肿瘤的复发；但也人认为肿瘤在早期就有了微转移灶，手术无法完全切除，术后化疗可以进一步杀死残存肿瘤细胞，延长患者无瘤生存时间。本研究中，侵及门静脉（包括微转移灶）、淋巴结转移、RhoC及MMP-9阳性表达分别为肿瘤术后复发的独立危险因素，对术后患者高危因素的评价可以指导术后治疗。
参考文献
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