作者：王正华 吴力群 韩冰
卢云 吕振华 刘相萍 杨堃 隋爱华 毕崇尧 李金朋
【摘要】 目的：观察脂质体介导的LIGHT和IFN-γ配比转染HepG2细胞后对其凋亡及Fas和FasL表达的影响。方法：将HepG2 细胞分为LIGHT单独转染组、LIGHT和IFN-γ联合转染组和空白对照组，以脂质体为中介转染HepG2细胞；分别于转染后12、24和48 h收集HepG2细胞，流式细胞术检测转染后HepG2细胞的凋亡率及Fas和FasL的表达。结果：LIGHT基因转染HepG2细胞能明显促进其凋亡，随时间延长凋亡率增加；Fas和FasL在HepG2细胞高表达，以Fas升高程度显著。结论：LIGHT和IFN-γ联合转染HepG2，其凋亡效果优于LIGHT单独转染，主要是通过上调Fas的表达来促进HepG2细胞凋亡。
【关键词】 细胞凋亡·LIGHT·IFN-γ·Fas/Fas-L·转染·HepG2细胞
【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression of Fas、FasL and the apoptosis of liver cancer cell line HepG2 transfected with LIGHT and IFN-γ gene mediated by Cationic liposome. Methods：HepG2 cells were pided into two groups (the solo transfection of LIGHT gene and the combined transfection of LIGHT and IFN-γ genes) and the control groups （no transfection）. HepG2 cells were cellected at 12h， 24h and 48h after transfection. The apoptosis of HepG2 cells and the expression of Fas and FasL of the HepG2 cells were investigated with flow cytometry. Results：After transfection， the apoptosis of HepG2 cells increased， and the apoptosis of combined transfection group was higher than the solo transfection of LIGHT（P＜0.01）. The expression of Fas and FasL increased in HepG2 cells（P＜0.01）， but the expression of FasL was lower than that of Fas. Conclusion: The effect of the combined transfection of LIGHT and IFN-γ genes is better than that of the solo transfection of LIGHT gene. LIGHT and IFN-γ can significantly promote cell apoptosis by regulating the expression of Fas.
【KEY WORDS】 Apoptosis·LIGHT·Interferon-γ·Fas/FasL·Transfection·HepG2 cell
原发性肝癌居我国恶性肿瘤致死类型的第二位［１］，其中90％以上为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。HCC恶性程度高、手术切除率低、预后差，全身化学治疗效果不佳，部分原因是HCC细胞的凋亡受阻［２］。本研究将LIGHT和INF-γ配比转染人肝癌细胞HepG2，检测其对凋亡现象及Fas和FasL表达的影响，以探讨促进HCC细胞凋亡的方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料与主要试剂 肝癌细胞株HepG2购于南京凯基生物科技有限公司，Fas和FasL抗体购于美国SANTA生物科技有限公司，Mouse IgG1/IgG1、FITC/PE标记抗体购于北京市晶美基因谷科技有限公司，Annexin V/FITC试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所，细胞培养基RPMI-1640和胎牛血清购于美国Gibco公司，Effectene Transfection Reagent购于德国QIAGEN公司。LIGHT表达质粒pcDNA4C-LIGHT cDNA和IFN-γ表达质粒pcDNA4His-MaxC-IFN-γ由我院中心实验室构建。
1.2 细胞培养和转染 肝癌细胞株HepG2培养基为含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、含5% CO2、饱和湿度的培养箱中常规传代培养。
将HepG2细胞接种于6孔板，每孔接种细胞数为2×105，设定转染组（LIGHT单转、LIGHT和IFN-γ联合转染组）和空白对照组（未转染组，加等量的未含胎牛血清的RPMI-1640培养液）各5个平行孔，置于5%CO2细胞培养箱中培养24 h后进行转染。转染试剂配比：单转为pcDNA4C-LIGHT-cDNA 0.6 μg、Enhancer 4.8 μL、Effectene 15 μL；联合转染为pcDNA4C-LIGHT-cDNA和pcDNA4His-MaxC-IFN-γ各0.3 μg、Enhancer 4.8 μL、Effectene 15 μL。转染步骤按QIAGEN公司脂质体转染试剂盒进行，分别于转染后12、24和48 h收集细胞备用。
1.3 流式细胞仪测定凋亡细胞 用去离子水按1：4稀释结合缓冲液备用。收集的细胞1 200 r/min离心5 min，去上清后用4 ℃预冷的PBS洗涤2次，再以250 μL结合缓冲液重悬细胞，调节浓度为1×106 mL-1。取100 μL细胞悬液到5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙锭溶液。吹打混匀后于室温避光孵育15 min。在反应管中加400 μL PBS，流式细胞仪分析。
1.4 细胞凋亡因子 Fas及FasL的检测 收集的细胞1 200 r/min离心5 min，去上清，100 μL PBS重悬，使其浓度为1×107 mL-1；吸取100 μL细胞重悬液到流式管内，每管内加20 μL Fas及FasL荧光抗体，置于避光的冰盒内震荡孵育15～30 min，每管内加入2 mL PBS，2 000 r/min离心10 min，吸出上清液，1%多聚甲醛500 μL重悬细胞，流式细胞仪检测。
1.5 统计学处理 应用SPSS 15.0软件包对数据行配对t检验及方差分析，所获数据以x±s表示，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HepG2细胞凋亡检测结果 双变量流式细胞术检测示HepG2细胞随时间的延长凋亡率增高，且LIGHT 单独转染组优于空白对照组，LIGHT和IFN-γ联合转染组优于LIGHT 单独转染组，P＜0.01（图1，表1）。
2.2 转染后Fas在HepG2细胞的表达 Fas的表达率随时间延长而增高，LIGHT基因单独转染组表达率高于空白对照组，LIGHT基因和IFN-γ联合转染组高于LIGHT基因单独转染组，P＜0.01（表2）。
2.3 转染后FasL在HepG2细胞的表达 FasL均呈高表达；12 h 和24 h LIGHT基因单独转染组表达率均低于LIGHT基因和IFN-γ联合转染组； 48 h LIGHT基因单独转染组FasL表达率高于联合转染组，P＜0.01（表3）。
3 讨论
LIGHT是1997年由Mauri研究发现的一个新肿瘤坏死因子超家族成员，又名TNFSF-14或HVEM-L［３］。目前已证实可与LIGHT结合的3种受体分别为LTβR、HVEM/TR2和DcR3/TR6 ，均为TNFRSF成员。研究发现，LIGHT一方面可与肿瘤细胞表达的凋亡受体LTβR结合，诱导肿瘤细胞凋亡，直接发挥抗肿瘤效应；另一方面，可以作为非CD28依赖性共刺激分子通过LIGHT—HVEM途径激活CTL反应和IFN-γ、GM-CSF等Thl型细胞因子的分泌来发挥间接杀肿瘤效应。熊刚等［4］在研究LIGHT对食管癌细胞株Eca109的抑制作用时发现，LIGHT通过下游分子实现其生物学效应需要一个较长的时间过程，认为单独转染LIGHT基因来对肿瘤进行免疫治疗的效果可能有限。本研究结果表明，就细胞凋亡和凋亡因子（Fas）而言，单一LIGHT基因转染HepG2细胞，均逊于LIGHT和IFN-γ联合转染。
IFN-γ是人体内最重要免疫调节因子，能以多种方式影响免疫应答，如可有效地增加细胞表面MHC抗原分子表达，有利于抗原递呈及增强免疫应答；IFN-γ还在巨噬细胞活化、细胞毒T淋巴细胞的诱导产生等方面具有重要作用［５］。肖若之等［６］观察到IFN和TNF联合使用后，HL-60细胞凋亡增加，认为IFN有增强TNF诱导细胞凋亡的作用。本研究将LIGHT和INF-γ联合转染人肝癌细胞HepG2，应用流式细胞术来检测细胞凋亡，结果显示联合转染组各时段HepG2细胞凋亡率均较对照组和LIGHT单独转染组增高（P<0.01），且随时间的延长凋亡越来越明显，表明IFN-γ能增强LIGHT诱导的HepG2细胞凋亡。
细胞凋亡主要有两条信号传递途径，即线粒体途径和死亡受体途径。肝癌细胞的凋亡被不同的途径调节，可结合细胞膜死亡受体如FasL、TNF-α或TNF相关的致凋亡配体，激活死亡受体途径［７］。Fas为典型的死亡受体，又名CD95、APO-1，属于TNF受体家族。Fas的天然配体为FasL，属TNF配体超家族成员。Fas/FasL凋亡途径参与机体防御、免疫监视、发育、衰老等过程，对维持细胞自稳态（homeostasis）和免疫系统的正常功能起重要用，Fas/FasL系统功能异常可使机体免疫系统失衡发生自身免疫性疾病，并与肿瘤发生有关。有研究表明，外周循环学sFas、sFasL水平与肿瘤的病理组织学分级、淋巴转移有关，对HCC有诊断价值［８］。
卢琳等［９］研究发现，白血病细胞表达Fas蛋白较正常骨髓细胞低，并能致共同培养的Jurkat细胞发生凋亡；而IFN-γ能提高其Fas蛋白的表达，且调节作用具有时间-剂量依赖性，并有下调白血病细胞致Jurkat细胞凋亡的能力，且能够增强白血病细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性及增强对化学治疗药物阿糖胞苷的敏感性。本研究表明，LIGHT基因转染HepG2细胞后，随着HepG2细胞凋亡率的升高，细胞凋亡因子Fas也同时升高，且LIGHT和IFN-γ联合转染效果显著优于LIGHT单独转染。虽然FasL随着HepG2细胞凋亡率的升高也有所升高，但是不如Fas升高显著，表明LIGHT和IFN-γ联合转染主要是通过上调Fas的表达来促进HepG2细胞凋亡。
HCC的发生发展是一个多因素参与的复杂过程，新型的基因治疗被给予厚望。LIGHT和IFN-γ联合应用可取得协同抗肿瘤作用，有望成为肿瘤治疗的新途径。
参考文献
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