中西医联合用药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响

【摘要】 [目的]观察不同治疗方法对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响。[方法]将40只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、糖尿病对照组、盐酸二甲双胍治疗组、中药治疗组和中西医联合用药组，小剂量两次腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠模型。中药治疗组和中西医联合用药组在造模前15天就进行预防性给药(以中药补肾通窍方煎剂灌胃)。西药组和中西医联合用药组在成模后给以盐酸二甲双胍给药。成模6W后将实验大鼠脱臼处死，取出眼球加入液氮磨碎，提取RNA，进行PCR电泳，再进行荧光PCR扩增，检测视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的情况。[结果]中西医联合用药组大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax表达跟其它组比较具有显著性差异(P<0.05)，有统计学意义。[结论]中西医联合用药可以有效影响糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因的表达，从而抑制糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的凋亡。

【关键词】 糖尿病大鼠;神经节细胞;基因;中西医

　　Abstract：[Objective]To observe the effect of different treatments on bcl2 and bax genetic expression of retinal ganglion cell in rats with diabetic retinopathy.[Methods]Forty male SD rats were randomly pided into 5 groups： normal group(N group )，diabetic group(D group)，metformin hydrochiloride treated group(MH group)，Chinese medicine treated group(C group)，Chinese western medicine combined treated group(CW group).D group was set up by injecting STZ twice in small volumes.In the C and CW groups，rats were orally administered with Bushentongqiao Formulation liquid for 15 days.Metformin hydrochloride was orally administered into the rats in MH and CW groups.Six weeks later，all the rats were killed and their eye balls were taken out and pulverized with fluid nitrogen to powder，from which RNA was extracted.Then RNA was electrophoresized and expanded in the way of PCR and fluorescent quantitative PCR respectively so as to investigate the bcl2 and bax genetic expression of retinal ganglion cell in rats with diabetic retinopathy.[Result]The bcl2 and bax genetic expression of retinal ganglion cell in the rats of CW group is significantly different from that in other groups，showing the statistical significance.[Conclusion]The Chinese western combined treatment has significant effect on bcl2 and bax genetic expression of retinal ganglion cell in rats with diabetic retinopathy，With a result of suppressing the apoptosis of retinal cell in diabetic rats.

　　Key words： diabetic rats;retinal cell;gene;Chinese and western medicines

　　糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的，由于胰岛素分泌缺陷及(或)其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。本实验通过观察不同方法治疗前后糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达情况，探讨中药补肾通窍方辅助西药盐酸二甲双胍对糖尿病大鼠视网膜凋亡相关基因表达的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物 选择由浙江中医药大学动物实验中心提供的清洁级健康成年熟雄性SD大鼠40只，体重(220±30)g，喂以平衡饲料，自由进食。

　　1.2 药物、试剂及引物 (1)药物：补肾通窍方为一临床经验方，由熟地15g，淮山药15g，枸杞子15g，黄芪15g，太子参15g，麦冬15g，五味子10g，当归15g，川芎15g ，葛根15g组成，购于浙江中医药大学附属第一医院浙江省中医院中药房，上述中药每剂煎两次，合并煎液过滤浓缩至3g生药/ml药液，放入无菌容器中4℃保存备用。盐酸二甲双胍0.25g/片，北京中惠药业有限公司生产，国药准字号：HI9983069)捣碎以蒸馏水配制成混悬液，每毫升含药物成分0.02g，置于4℃冰箱保存备用。(2)试剂：链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自Sigma公司。Trizol试剂购自Inxitogen 公司，bcl2和bax引物委托生物公司合成。(3)引物设计与合成：引物序列如下：bcl2上游引物：5′GTGGGGAGCGTCAACAGG3′，下游引物：5′GACAGCCAGGAGAAATCAAAC3′;bax上游引物：5′ GGGCTGGACACTGGACTTC 3′，下游引物：5′ AGCGAGGCGGTGAGGACT3′;GAPDH 上游引物：5′GACAACTTTGGCATCGTGGA3′，下游引物：5′ATGCAGGGATGATGTTCTGG3′，委托上海生物公司合成。

　　1.3 分组及造模 大鼠饲养一周后随机分为五组：正常对照组(C组)，糖尿病组(DM组)，盐酸二甲双胍治疗组(X组)，中药治疗组(Z组)和中西医联合治疗组(ZX组)，每组8只。用0.1mol/L新鲜配制的枸橼酸枸橼酸钠缓冲液(PH=楼航芳，等: 中西医联合用药对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞bcl2和bax基因表达的影响

　　4.4)配制2%STZ，过滤除菌后备用。除C组外其余四组大鼠分两次分别在禁食12h后腹腔注射STZ40mg/kg体重剂量造模，C组大鼠一次性腹腔注射同等剂量的枸橼酸枸橼酸钠缓冲液，3d后重复一次腹腔注射STZ(25mg/kg)。7d后测尾静脉血非禁食血糖(美国强生One TouchⅡ血糖仪)，血糖大于16.7mmol/L，尿糖(～)，上述指标持续1周的动物为成功的糖尿病大鼠模型。自确定成模后，每周记录尿糖2次，称量体重1次，测空腹血糖1次。

　　1.4 给药 Z组和ZX组大鼠在造模前15天开始以补肾通窍方煎剂( 13.05g/kg)灌胃给药，C组和DM组大鼠给以同等剂量去离子水灌胃，X组大鼠成模前给以同等剂量去离子水灌胃，成膜后每天以盐酸二甲双胍混悬液( 0.09g/kg)灌胃。

　　1.5 眼球的取材及切片 成膜后第6w末，各组大鼠脱臼处死，迅速摘取眼球，于锯齿缘后0.5mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，投入液氮中以备荧光PCR检测。

　　1.6 荧光PCR实验方法 (1)RNA提取：①取出样品，加入预冷TRIzol试剂1ml，用研磨器冰浴研磨10～15min，室温放置5 min;②加入氯仿0.2 ml，用力振摇，室温放置23 min;③4℃最大转速12，000 g离心15 min，吸取上层水相，移置另一离心管;④加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min;⑤4℃最大转速12，000 g离心10 min，弃上清;⑥加入75%乙醇1 ml，充分洗涤沉淀后于4℃、10000 g离心5 min，弃上清，室温干燥;⑦加入适量的DEPC水溶解，利用紫外分光光度计在260nm测定并提取5ugRNA进行逆转录。(2)cDNA合成：①以mRNA为模板，配置逆转录反应液，短暂离心后，加入如下组分：5×第一链反应缓冲液 2μl、Oligo dT引物0.5μl 逆转录酶0.5ul，总RNA1ul.，采用DEPC水补齐到10 μl;②轻轻混匀后，混合物在37℃中放置20min;③85℃加热l5sec终止反应，至冰上。(3)荧光PCR反`应：① PCR反应体系，见表1。表1 PCR反应体系②PCR反应条件：94℃5min，再将反应条件变为94℃、15s，60℃，45s，循环扩增40次。60℃检测荧光值。

　　1.7 电子计算机图像分析及统计处理 用荧光PCR仪所得的实验组别各样本数据，根据指标不同，数据分别跟GAPDH比对后所得数据采用SPASS13.0进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 PCR电泳结果 对所有样本根据组别进行bcl2和bax基因片段普通PCR，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，可见在160bp左右的特异性条带，见图1。图2 荧光PCR扩增结果2.3 荧光PCR扩增CT值 将测得的各组CT值进行比对后，进行统计分析。可见bcl2 CT值DM组最高，ZX组最低，表明组织中bcl2基因表达ZX组最强，DM组最弱;跟C组比较：ZX组低于C组，其余各组均高于C组，但只有DM组跟ZX组有显著性差异(P<0.05);跟DM组比较：3个治疗组bcl2基因表达均有所增强，但只有X组跟ZX组有差异(P<0.05);ZX组跟X组和Z组比较都有显著性差异(P<0.05)。结果见(表1)。Bax CT值，在ZX组最高，DM组最低，表明bax基因表达在DM组最强，在ZX组最弱; C组跟X组比较，组间无差异(P>0.05)，跟其它各组比较，组间具有显著性差异(P<0.05);跟DM组比较，只有X组和ZX组有明显差异(P<0.05);3个治疗组之间比较，组间差异显著(P<0.05)。结果见表1。表1 实验各组大鼠bcl2、bax基因表达情况与C组比较，*P<0.05;与DM组比较，△P<0.05;与X组比较，★P<0.05;与Z组比较，﹟P<0.05

　　3 讨论

　　细胞凋亡是在生理或病理条件下，通过细胞凋亡外通道和内通道激发了蛋白酶组成的级联反应，并受细胞内部多种基因的直接调控，其中最具代表性的的为抑制凋亡的bcl2和促进凋亡的bax。

　　糖尿病视网膜病变(DR)属中医学视瞻昏渺、萤星满月、血灌瞳仁、暴盲等范畴[2]。糖尿病日久，阴津亏损，燥热偏盛，耗气伤阴，致气阴两虚及阴阳两虚，使脉络瘀阻，血行失常。谢学军等[3]观察糖尿病患者186例，认为肾虚是DR发生的基础，肝肾虚损，阴损及阳，目失所养是导致DR发生发展的基本病机;心脾亏虚，因虚致瘀，目窍闭阻则是DR发展过程中的重要因素;本虚标实，虚实夹杂为其症候特点。在糖尿病中医证型与DR分期关系的研究中发现[4]：DR单纯期和增殖前期以气阴两虚证为主，增殖期以气滞血瘀、阴阳两虚证为主，提示DR病证有从气阴两虚→气滞血瘀→阴阳两虚演化的趋势。本实验采用盐酸二甲双胍、补肾通窍方、盐酸二甲双胍联合补肾通窍方三中不同方法治疗，观察凋亡相关基因bcl2和bax的表达情况，发现中西医联合用药，能有效增强视网膜神经节细胞bcl2的表达，降低bax的表达，而且明显比单纯使用中药或西药治疗效果明显，这可能跟中西医联合用药能有效阻断细胞凋亡内外通道相关。表明在西医治疗同时，辅以益气养阴、行气活血、补肾通窍中药的治疗，从整体调节治疗糖尿病视网膜病变。

参考文献

　[1] 张承芬，张惠荣.糖尿病的眼部并发症及治疗[M].北京：人民卫生出版社，2003:前言.

　　[2] 金宝良.糖尿病继发视网膜病变的分型辨治及体会[J].河北中医，1997，19(2)：22.

　　[3] 谢学军，王明芳.糖尿病视网膜病变的病机探讨[J].中国中医眼科杂志，1995，5(2)：8688.

　　[4] 李志英，余杨桂，张淳，等.糖尿病中医证型与糖尿病视网膜病变分期关系的探讨[J].中国中医眼科杂志，2000，10(1)：2932.