多西环素对乳腺癌移植瘤小鼠MMP2及TIMP2 mRNA表达的影响

　　　　　　作者：甘萍 李艾珊 聂桂丽 范英昌

【摘要】 目的 研究多西环素在小鼠乳腺癌肺转移模型中对基质金属蛋白酶2(MMP2)及金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP2)mRNA表达的影响。方法 30只TAⅡ近交系小鼠建立肺转移性乳腺癌BCMLTAⅡ99模型，随机分为对照组及给药组，每组15只，于可触及肿物后次日，给药组腹腔注射盐酸多西环素0.1 ml(10 mg/ml)，对照组给予等量生理盐水。7 w后处死动物，剥离肿瘤称重，部分新鲜组织采用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)方法检测肿瘤组织MMP2及TIMP2 mRNA表达水平。结果 多西环素给药组小鼠肿瘤生长大小及转移率分别为(2.718±0.337)g和13.3%均低于对照组〔(4.313±0.468)g，53.3%，P＜0.01，P＜0.05〕。与对照组比较，多西环素治疗组MMP2 mRNA为0.637±0.088，明显低于对照组 (1.035±0.097，P＜0.05)；TIMP2 mRNA为0.778±0.148，明显高于对照组 (0.484±0.125，P＜0.05)。结论 多西环素通过调节MMP2及TIMP2 mRNA的表达水平，对小鼠乳腺癌肺转移模型中肿瘤生长及转移发挥抑制作用。

【关键词】 多西环素；乳腺癌；基质金属蛋白酶2；金属蛋白酶组织抑制因子2

　　【Abstract】 Objective To study effect and mechanism of doxycycline on the mRNA expressions of matrix metalloproteinase (MMP)2 and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)2 in breast cancer with lung metastasis model mice (BCMLTAⅡ99). Methods 30 TAⅡ99 mice of breast cancer models with lung metastasis were randomly pided into doxycycline treatment group and control group. Mice in treatment group were injected with doxycycline and those in control group with physiological saline solution everyday when tumor could be touched. 7 weeks later， all mice were killed. All tumors were peeled off and weighted， then small parts of tumors were used to detect the expressions of MMP2 mRNA and TIMP2 mRNA by the RTPCR. Results Both tumor weight and metastasis rate in treatment group were lower than those of control group (P＜0.05). The expression of MMP2 mRNA was lower and the expression of TIMP2 mRNA was higher in treatment group than that of control group (P＜0.05). Conclusions Doxycycline can inhibit tumor growth and metastasis in breast cancer with lung metastasis model mice by regulating MMP2 mRNA and TIMP2 mRNA expression.

　　【Key words】Doxycycline; Breast cancer; Matrix metalloproteinase (MMP)2; Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)2

　　肿瘤患者的生存率与肿瘤的侵袭和转移密切相关，而细胞外基质(ECM) 的降解是肿瘤完成侵袭和转移的先决条件。基质金属蛋白酶(MMPs)在ECM的降解中起重要作用〔1〕。MMPs活性主要由基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节。研究表明MMPs/TIMPs调节失衡在肿瘤转移中起决定性作用〔2〕。多西环素是一种四环素类抗生素，除具有抗菌作用外，还是一种MMPs的广谱抑制剂。本研究通过建立小鼠肺转移性乳腺癌BCMLTAⅡ99模型，成瘤后给予多西环素处理，观察其对MMP2和TIMP2表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　TAⅡ近交系雌性小鼠30只，8周龄，体重18～21 g，平均20 g，由天津医科大学动物室提供。小鼠肺转移性乳腺癌BCMLTAⅡ99模型，引自天津医科大学附属肿瘤医院研究所。

　　1.2 主要试剂

　　Trizol(一步法) RNA提取试剂盒及RNA酶抑制剂均为Gibco公司产品。RTPCR试剂盒及Marker DL2000均为上海宝生物工程有限公司。ID柯达凝胶成像系统，Eppendorf梯度PCR仪，ABI Gene Amp PCR System 9700。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

　　1.3 方法

　　1.3.1 建模及实验分组

　　30只小鼠随机分为对照组及给药组，各15只，按照文献〔3〕建模 (第92代BCML瘤株传代小鼠，颈椎脱臼法处死后，无菌条件下取癌组织，剪切成2 mm3小块，置于生理盐水中，分别接种于30只小鼠左下腹乳腺区域)。造模后于小鼠皮下出现可触及肿块后次日开始给药，对照组每天腹腔注射0.1 ml生理盐水，给药组每天腹腔注射盐酸多西环素0.1 ml (10 mg/ml)，共7 w。

　　1.3.2 取材方法

　　停药后处死小鼠，解剖取肿瘤组织，完整剥离后称重，取肿瘤组织1 cm×0.5 cm×0.5 cm，放入冻存管，迅速投入液氮罐，用以检测MMP2和TIMP2 mRNA。

　　1.3.3 RNA提取

　　采用Trizol一步法RNA提取试剂盒提取肿瘤组织总RNA，用分光光度计测定吸光度值(OD)值，并用电泳法鉴定分子完整性。

　　1.3.4 逆转录反应
　　
　　用逆转录酶链反应(RTPCR)方法，取总RNA 10 μl，1‰DEPC水17.4 μl，5×Buffer 10 μl，2.5 mmol/L dNTP 8 μl，RNA酶抑制剂 0.5 μl，AMV (10 μg/μl) 1 μl，随机引物1 μl，总体积50 μl，42℃ 1 h，95℃ 10 min，冰浴+1%DEPC水50 μl后达体积100 μl。

　　1.3.5 PCR扩增

　　10×Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，2.5 mmol/L，dNTP 4 μl，引物各1 μl，cDNA 10 μl，Taq酶0.5 μl，加双蒸水后总体积达50 μl，振荡混匀。循环条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃后延伸7 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，以凝胶成像系统进行半定量分析，用MMP2、TIMP2与βactin比值表示其相对表达水平。MMP2引物序列：上游5′CTATTCTGCCAGCACTTTGG3′，下游5′CAGACTTTGGTTCTCCAACTT3′，扩增产物长度310 bp；TIMP2引物序列：上游5′CTCGCTGGACGTTGGAGGAAAGAA3′下游5′AGCCCATCTGGTACCTGTGGTTCA3′，扩增产物长度150 bp；βactin引物序列：上游：5′ATATCGCTGCGCTGGTCGTC3′，下游：5′AGGATGGCGTGAGGGAGAGC3′，扩增产物长度517 bp。

　　1.4 统计学分析

　　计数资料用x±s，采用SPSS13.0软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 多西环素的抑瘤及抗转移作用

　　实验过程中给药组小鼠一般状况较对照组好，给药组平均瘤重(2.718±0.337)g明显低于对照组〔(4.313±0.468)g，P<0.01〕，给药组肺转移率为13.3%(2/15)低于对照组53.3%(8/15)(P<0.05)。

　　2.2 多西环素对MMP2及TIMP2 mRNA表达的影响

　　见图1。示MMP2、TIMP2及βactin经PCR扩增获得片段大小分别为310、150和517 bp。给药组MMP2、TIMP2 mRNA表达水平分别为0.637±0.088和0.778±0.148，与对照组(1.035±0.097)，(0.484±0.125)差异显著(P＜0.05)。

　　3 讨 论

　　乳腺癌的发生和发展过程和其他恶性肿瘤一样，受诸多因素的影响，其过程分为潜伏期、侵袭期和转移期。其中通过降解ECM改变基底膜的完整性是决定癌细胞是否浸润转移的关键因素。目前已知的蛋白降解酶有丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及MMPs。

　　MMPs是一类锌离子依赖的内肽酶，能降解多种ECM，在肿瘤的侵袭转移中发挥促进作用。其中MMP2可分解细胞基底膜和ECM的骨架成分(Ⅳ型胶原)，因而成为乳腺癌转移过程的关键因子〔4〕。研究发现癌细胞穿透人工基底膜的能力与MMP2表达水平显著正相关，生长旺盛、增殖活跃的癌细胞MMP2蛋白的表达水平明显增强〔5〕，应用MMP2抑制剂可显著降低癌细胞增殖活性及侵袭能力〔6〕，从而延缓恶性肿瘤的发展速度，表明MMP2在促进肿瘤生长增殖和浸润转移等过程中发挥着重要的作用。TIMPs是MMPs的天然抑制物，其表达与肿瘤低侵袭性和良好预后具有相关性，其中MMP2的特异性抑制物为TIMP2。有研究显示MMPs与TIMPs表达失衡与肿瘤的侵袭转移密切相关〔7〕。

　　多西环素属于四环素类抗生素，亦是广谱高效的MMPs抑制剂，能从转录水平抑制MMPs的表达，也可以通过与MMPs的活性位点结合直接抑制其活性。有实验表明多西环素能抑制U20S骨肉瘤细胞和MDAMD435乳腺癌的侵袭和转移，抑制MDAMD435乳腺癌细胞MMP2和MMP9的分泌〔8〕。Seftor等〔9〕证明化学改良的四环素在MUM2B人黑色素瘤细胞的三维培养中可抑制MMPs表达。多西环素亦可通过调节MMPs/TIMPs表达水平，抑制黑色素瘤的生长〔10〕。本研究结果表明，在小鼠肺转移性乳腺癌BCMLTAⅡ99模型中，多西环素可抑制小鼠乳腺癌肿瘤组织的生长和转移。且抑制乳腺癌肿瘤组织中MMP2 mRNA的表达，亦可以增加TIMP2的表达。

　　综上所述，MMPs抑制剂多西环素可通过调节MMP2和TIMP2的表达水平抑制乳腺癌肿瘤组织的生长和转移。同时，本研究中给药组小鼠腹腔注射多西环素后一般状态与对照组相比未见明显异常，在用药期间亦未见明显毒副作用，因此多西环素对乳腺癌肿瘤的生长及侵袭具有一定的临床应用价值。

参考文献

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