基质金属蛋白酶在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

【关键词】 基质金属蛋白酶；心肌；缺血再灌注损伤

近年研究表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)参与血小板聚集、心肌缺血再灌注损伤等急性过程。在多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌梗死、心衰、心室重构、动脉损伤后新生内膜形成中发挥重要作用。适当抑制MMPs有望成为治疗心血管疾病的药物靶点。本文就MMPs的结构、功能与生化以及在缺血再灌注损伤中的作用综述如下。

　　1 MMPs 的三维立体结构〔1〕
　　
　　由一个5端β折叠片，3个 螺旋和连接环组成主链。总体来讲，蛋白水解酶区域是由一个起触媒作用的锌、一个结构(上)的锌和三个钙离子组成。底物连接裂口是由IV链、β螺旋和β螺旋后的延长环区域组成。三个组氨酸配位活性位点锌。环区域包括保守的“蛋氨酸旋转”，它是起触媒作用的锌周围起支持结构的基础。

　　2 MMPs功能与生化
　　
　　自从1962年Gross和Lapiere发现第一种MMPs胶原酶以来，目前已发现约有66 种MMPs (包括25 种人类的MMPs) 。根据它们的结构与底物的不同，可分为六大类：胶原酶、基质溶素、基质溶解因子、明胶酶、膜型MMPs（MTMMP）、其他MMPs基质金属蛋白酶。
　　
　　MMPs是结构上与锌相关的肽链内切酶家族。MMP在细胞外基质正常的降解过程中发挥重要的作用，这些生理过程包括：组织形成、组织修复、血管生成等。另外它也参与细胞外基质的过度降解过程。病理过程包括：风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、牙周炎和皮肤的自身免疫水泡病、皮肤的光老化、肿瘤浸润和肿瘤转移等〔2〕。

　　3 MMPs的激活与调节
　　
　　大多数情况下，MMPs的蛋白水解的活化是逐步的。初期的蛋白水解发生在酶原的第一个和第二个螺旋之间的显露区域。一个MMP序列的发现表述了“诱饵”区域裂口特异性。一旦酶原的一部分被移动，这就可能影响酶原的其他部分，包括半胱氨酸开关锌相互作用，将通过部分MMPs媒介物活化或者其他有活性的MMPs导致分子间的相互作用。
　　
　　MMPs的活化方式主要为：细胞内的活化和细胞表面活化。Pei 和 Weiss首次证实了成对碱性氨基酸蛋白酶在细胞内活化MMP11。MMP2的主要活化发生在细胞表面受 MTMMP介导。

　　4 基质金属蛋白酶的活性的调节
　　
　　在正常生理条件下，其调节分为4个水平:①转录水平的调节:MMPs在转录前与转录后均受调节。多细胞因子（IL1、IL6、IL8、INF α、INFγ、GCSF、EGF、PDGF、TGFβ）等均能在转录水平上调节MMP的表达，但这种调节会因许多因素的不同而异，并且细胞因子对MMPs的调节存在着协同作用。②酶原活化的调节：绝大多数MMP mRNA经翻译、修饰后以酶原形式分泌入细胞外基质中，必须裂解去除前肽区才能被激活而具备生物学功能。近来发现核转录因子（NFκB）可调控MMPs在内的许多靶基因，NFкB受缺氧/氧过多、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生长素、细菌病毒产物如脂多糖、放射性物质等诸因素刺激，最终使MMP9等一系列基因表达水平增高。③特殊的细胞外基质（ECM）成分的相互作用：ECM 不仅仅是细胞外的支架，它也起到生物活性分子的储存池的作用。在蛋白水解作用中能表达潜在的生物学功能。④内源性抑制剂金属蛋白组织抑制物（TIMP）的调节：活化的MMPs能被其天然抑制物TIMP所抑制，调节主要在两个方面，其一与proMMPs共价结合直接抑制MMP的活化；其二是与活化的MMPs结合形成1∶1复合体，进而抑制其活性。

　　5 MMPs与心肌缺血再灌注损伤

　　5.1 缺血再灌注损伤心肌中MMPs的来源与分布 尚不明确再灌注损伤后MMPs究竟来源何处，既往研究表明可能来源于三个方面：①可能是冠状动脉及其周围基质等部位纤维样细胞，再灌注后刺激血管内纤维细胞分泌或合成MMPs〔3〕；②可能是来自炎症细胞〔4〕，心肌缺血再灌注后刺激大量炎症细胞产生并浸润心肌组织，从而分泌并激活MMPs；③可能与某些细胞因子有关，现已证实心肌缺血再灌注早期可产生大量的细胞因子如白细胞介素1（IL1）、肿瘤坏死因子α（TNFα）等，这些细胞因子可诱导大量MMP的表达。
　　
　　MMPs表达的位置在心肌缺血再灌注损伤时还不十分明确。Wang等〔5〕采用电镜免疫荧光技术观察到大鼠离体心脏经缺血再灌注处理后，MMP2主要表达于心肌细胞胞浆，并且其阳性免疫反应主要存在心肌纤维的细肌丝和部分线粒体中。进一步用双重免疫荧光标记法研究发现，MMP2与肌钙蛋白（TnI）紧密结合并位于心肌细胞中，提示TnI可能是心肌缺血再灌注损伤过程中MMP2的最终靶点。文献〔6〕报道，MMP1主要存在于正常心肌组织和非缺血区心肌的心内膜、心外膜、冠状动脉及其周围基质，但心肌细胞没有表达。而缺血区心肌MMP1广泛分布于心肌细胞胞浆，且主要位于中三分之一的心肌层。非缺血区心肌MMP9的阳性表达只存在于少数细胞，如心内膜、内皮下组织的细胞，这些细胞位于心肌细胞外间质中，可能是基质细胞或白细胞。在缺血区心肌中MMP9的阳性表达明显增强，呈灶性分布于整个心肌组织，并位于心肌细胞之间的间质中，如血管外膜连接组织、血管内膜和小血管壁。

　　5.2 MMPs在心肌缺血再灌注损伤中的作用 心肌缺血再灌注损伤的作用机制极其复杂，至今仍未完全明了，主要是钙超载学说、自由基学说和中性粒细胞浸润学说占主导。近年来有研究显示MMP参与了心肌缺血再灌注损伤，从而使人们对心肌缺血再灌注损伤的机制在分子水平上有了更深的了解。而且也使得近年来对MMP在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究成为又一个新的热点。
　　
　　Cheung等建立大鼠离体心脏缺血再灌注模型(全心缺血25 min，复灌30 min)，运用酶谱分析法检测冠状动脉漏出液中MMP2的活性，发现再灌注时MMP2释放明显增加，于复灌1 min达到高峰，并且MMP2的释放量与心功能之间呈明显的负相关；在灌流液中加人纯化的MMP2，可使缺血再灌注后心功能恶化，而用含MMP2抗体的灌流液灌注，可对缺血再灌注心肌起保护作用；用MMP2特异性抑制剂菲洛林后可降低MMP2的释放及改善心功能，并呈浓度依赖性。又有发现异种移植心脏中MMP2活性明显增高，并伴有层黏连蛋白、Ⅳ型胶原的降解增加，但proMMP2的表达水平并没有明显改变。而同种移植心脏中MMP2明显低于异种移植心脏，层黏连蛋白和Ⅳ型胶原的降解也比较少，以MMPs抑制剂巴马司他处理异种移植心脏后，MMP2和层黏连蛋白、Ⅳ型胶原的降解均显著减少〔7〕。认为异种移植心脏MMP2的活性明显增高，使得心肌细胞外基质中的层黏连蛋白、Ⅳ型胶原降解增加，从而导致缺血再灌注损伤，其机制可能是异种移植心脏的宿主排斥反应引起MMP的激活。Wang〔8〕等用过氧亚硝酸盐(0N00)注人SD大鼠离体缺血再灌注心脏，结果发现10 min后MMP2的释放量迅速增加，并伴有心功能的持续恶化，说明自由基对缺血再灌注心肌的损伤至少部分是通过激活MMPs来介导的。同样中性粒细胞也可以介导心肌缺血再灌注过程中MMPs的释放与激活。
　　
　　然而，有学者通过结扎猪左前降支6 h并再灌注3 h进行研究时发现〔9〕，缺血区心肌MMP2活性没有改变，且用免疫组织化学法亦未检测到其阳性表达，其原因可能与动物模型和/或缺血再灌注的时间长短的不同有关，但缺血区心肌MMP1和9的活性(酶谱分析法)和表达(免疫组织化学法)较非缺血区心肌明显增加。Chen等对大鼠在体心脏进行缺血再灌注处理(缺血1 h，再灌注1 h)后，血清MMP1的含量明显增高，但用重组转化生长因子（TGF）β预处理后，大鼠心功能明显好转，心梗面积减小，同时降低了MMP1含量。
　　
　　Cho等〔10〕利用MMP9 基因缺失小鼠实施血管剥脱术后发现，平滑肌细胞（SMC）迁移和增殖明显减少，MMP9 活性在正常小鼠动脉检测不到。然而损伤4 h 后，其活性明显增加，在24 h 达最高峰，持续高表达至7 d ，14 d 后活性消失。比较而言，MMP2 在正常的和损伤的血管都有表达，在损伤4 d 后其活性才开始上升并持续到14 d 以后。SMC 在损伤6 d 后迁移至内膜。因此MMP2 与MMP9 参与调节SMC 迁移与增殖，其中MMP9 在损伤早期表达对SMC 增殖并迁移作用至关重要。有目的去除MMP9 基因后，可减弱小鼠实验性心肌梗死后的左室扩张，胶原积聚减少，表明MMP9 在心肌梗死后基质重塑中起重要作用〔11〕 。由此可见，MMP9参与冠心病发生、发展全过程。
　　
　　Lindsey等〔4〕建立犬在体缺血再灌注模型(缺血1 h，再灌注5 d)并收集心脏淋巴液，用免疫细胞化学法检测淋巴液中MMP9和中性粒细胞的阳性率。发现在整个实验过程中MMP9的变化趋势和中性粒细胞几乎一致，两者之间呈明显正相关，并用明胶酶谱分析法测定淋巴液中MMP9的变化，结果发现心肌缺血再灌注后MMP9的水平明显增高，说明MMP9可能是心脏淋巴液中的中性粒细胞所分泌。为证实MMP9是被中性粒细胞所激活，将心肌组织冰冻切片用荧光素标记的明胶孵育后，以双重免疫荧光组织化学法检测，发现缺血再灌注心肌MMP9的阳性细胞明显多于假手术组和非缺血对照组，并主要位于中性粒细胞聚集的部位。提示MMP9可能是在心肌组织中被中性粒细胞激活，但中性粒细胞是如何激活MMP9目前尚不清楚。鉴于核转录因子(NFκB)在MMP9 上调中的独特作用〔12〕，而且NFκB是炎症的启动因子，对中性粒细胞的活化也起作用，所以寻求抑制MMP9的药物，应该从作用NFκB为主要着眼点。大量研究表明，腺苷能够有效的抑制缺血再灌注损伤中NFκB的活性，能否产生对MMP9的抑制，国内外很少有人研究，成为很有发展前景的研究方向。

　　
　　目前为止，众多的临床研究也发现MMP与心肌缺血再灌注损伤有着密切的关系。1997年Hirohata等〔13〕研究了13名首次发生急性心肌梗死并使冠状动脉成功再通的病人血清MMP1水平不同时间的改变，结果发现冠状动脉再通后血清MMP1的水平前4 d较冠状动脉再通前低，第5天开始升高并于第14天达到高峰。Hojo等〔14〕对47名左冠状动脉狭窄并行经皮冠状动脉成形术(PTCA)的病人进行了研究，发现行PTCA术后，病人血浆MMP1、MMP2的水平显著升高，TIMP1也升高，但TIMP2无明显改变，而且MMP2/TIMP2的以及MMP2活性显著增高，认为由于MMP1，2活性和MMP2/TIMP2的比值的增加造成经皮冠状动脉成形(PTCA)术后的缺血再灌注损伤。
　　
　　综上所述，①无论是动物实验(尽管MMPs在不同动物实验中的表达时程不尽相同)抑或临床人体研究都说明MMPs和/或MMP/TIMPs比值升高可能是心肌缺血再灌注损伤机制之一；②中性粒细胞、自由基不仅可以直接造成缺血再灌注损伤，而且分别能够通过分泌和/或激活MMPs来介导；③MMPs参与这一过程可能受某些细胞因子的调节，这有待于进一步的研究。
　　
　　目前的主要检测方法有8种基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的检测方法:①免疫组织化学技术；②酶联免疫吸附法(ELISA)；③单克隆抗体测定；④mRNA提纯和分析；⑤明胶酶谱学；⑥Northern印迹法；⑦反转录聚合酶链反应(RTPCR)；⑧原位杂交法。

　　6 结论和展望
　　
　　由于MMPs能降解ECM成分，所以在很多生理的病理的过程中是非常重要的。ECM不仅仅是细胞骨架，而且在蛋白水解作用中已经显现有其他潜在的生物功能。这些进一步阐述了细胞、细胞外基质及其分解代谢之间的相互作用。 对于MMPs 的生物学和结构方面的研究已经非常的深入，包括它们的活化和催化机制、底物特异性。人们正在研究怎样抑制MMPs 活性以减轻I/R 损伤发生。理论上抑制MMPs 活性可通过以下途径:①加入外源性TIMPs;②减少局部MMPs 产生〔15～17〕;③促进局部TIMP 合成〔18，19〕;④研制人工合成的MMPs 抑制剂。根据对结构的分析研究，已经设计很多有效的人造的基质酶抑制剂，其中有一些已经在肿瘤和关节炎的动物模型中表现出疗效。MMP在心脏疾病的发展及临床预后方面均有密切关系，很多方面仍需进一步探讨。

参考文献

　　1 Visse R，Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases structure，function，and biochemistry 〔J〕.Circ Res，2003;92:827.

　　2 Ravanti L，Kahari VM.Matrix metalloproteinases in wound repair (review)〔J〕.Int J Mol Med，2000；6(4):391407.

　　3 Chen H，Li D，Saldeen T，et al.TGFbeta 1 attenuates myocardial ischemiareperfusion injury via inhibition of upregulation of MMP1 〔J〕.Am J Physiol 2003;284(5):16127.

　　4 Lindsey M，Wedin K，Brown MD，et al.Matrixdependent mechanism of neutrophil mediated release and activatioin of matrix metalloproteinases9 in myocardial ischemia/reperfusion〔J〕.Circulation，2001;103(17):2 1817.

　　5 Wang W，Schulze CJ，SuarezPinzon WL，et al.Intracellular action of matrix metalloproteinase2 accounts for acute myocardial ischemia and reperfusion injury〔J〕.Circulation，2002;106(12):15439.

　　6 Chung L，Shimokawa K，Dinakarpandian D，et al.Identification of the (183)RWTNNFREY(191) region as a critical segment of matrix metalloproteinase 1 for the expression of collagenolytic activity〔J〕. J Biol Chem，2000;275（38）:296107.

　　7 Falk V，Soccal PM，Grunenfelder J，et al.Regulation of matrix metalloproteinases and effect of MMPinhibition in heart transplant related reperfusion injury 〔J〕.Eur J Cardiothorac Surg，2002;22(1):1538.

　　8 Wang W，Schulze CJ，SuarezPinzon WL，et al.Intracellular action of matrix metalloproteinasez accounts for acute myocardial ischemia and reperfusion injury〔J〕.Circulation，2002;106(12):1 543549.

　　9 Danielsen CC，Wiggers H，Andersen HR.Increased amounts of collagenase and gelatinase in porcine myocardium following ischemia and reperfusion〔J〕.J Mol Cell Cardiol，1998;30(7):143142.

　　10 Cho A，Reidy MA.Matrix metalloproteinase9 is necessary for the regulation of smooth muscle cell replication and migration after arterial injury〔J〕.Circ Res，2002;91：84551.

　　11 Duharme A，Fratz S，Aikawa M，et al.Targeted deletion of matrix metalloproteinase9 attenuates left ventricular enlargement and collagen accumulation after experimental myocardial infarction〔J〕.J Clin Invest，2000;106(1):5562.

　　12 Yan C，Wang H，Aggarwal B，et al.A novel homologous recombination system to study 92 kDa type IV collagenase transcription demonstrates that the NFκB motif drives the transition from a repressed to an activated state of gene expression 〔J〕.FASEB，2004;18(3):5401.

　　13 Hirohata S，Kusachi S，Murakami M，et al.Time dependent alterations of serum matrix metalloproteinase1 and metalloproteinase1 tissue inhibitor after successful reperfusion of acute myocardial infarction〔J〕. Heart，1997;78(3):27884.

　　14 Hojo Y，Ikeda U，Katsuki T，et al.Matrix metalloproteinase expression in the coronary circulation induced by coronary angioplasty〔J〕. Atherosclerosis，2002;161(1):18592.

　　15 Thum T，Fraccarollo D，Galuppo P，et al.Bone marrow molecular alterations after myocardial infarction:impact on endothelial progenitor cells〔J〕.Cardiovasc Res，2006；70(1):5060.

　　16 Spinale FG，Escobar GP，Hendrick JW，et al.Chronic matrix metalloproteinase inhibition following myocardial infarction in mice:differential effects on short and longterm survival 〔J〕.J Pharmacol Exp Ther 2006;318(3):96673.

　　17 Yasuda S，Miyazaki S，Kinoshita H，et al.Enhanced cardiac production of matrix metalloproteinase2 and 9 and its attenuation associated with pravastatin treatment in patients with acute myocardial infarction〔J〕. Clin Sci (Lond)，2007;112(1):439.

　　18 Halapas A，Zacharoulis A，Theocharis S，et al.Serum levels of the osteoprotegerin，receptor activator of nuclear factor kappaB ligand，metalloproteinase1 (MMP1) and tissue inhibitors of MMP1 levels are increased in men 6 months after acute myocardial infarction 〔J〕.Clin Chem Lab Med，2008;46(4):5106.

　　19 Beeri R，Yosefy C，Guerrero JL，et al.Mitral regurgitation augments postmyocardial infarction remodeling failure of hypertrophic〔J〕.J Am Coll Cardiol，2008;51:47686.