钙离子对小鼠海帕西啶mRNA表达的影响

　　　　　　 作者：郭晓强 肖维富 杨勇 姚清国

【摘要】 目的 研究钙离子在海帕西啶表达调节中的作用。方法 昆明小鼠被分为4组，分别腹腔注射等渗的NaCl、MgCl2、CaCl2和FeCl3溶液，采集血清和肝脏组织，血清铁和总铁结合力使用试剂盒检测，肝脏海帕西啶mRNA含量使用半定量RTPCR确定。结果 和钠离子相比，钙离子可减少血清铁含量（P＜0.05），同时抑制海帕西啶mRNA表达（P＜0.05）。结论 钙离子可通过调节海帕西啶mRNA表达而影响铁代谢。

【关键词】 钙离子；海帕西啶；铁代谢

铁是机体生长发育所必需的微量元素，参与生物氧化和DNA复制等生物学过程，然而铁过多可造成生物损伤。海帕西啶（hepcidin）是2000年发现的一种主要在肝脏内表达、具有铁调节功能的小肽〔1〕，可通过诱导小肠上皮细胞或巨噬细胞表面铁输出蛋白（ferroportin1，Fpn1）细胞内吞和降解而达到减少血清铁的目的〔2〕。海帕西啶表达受多种因素影响，如炎症和铁沉积可诱导表达，而贫血和缺氧则抑制其合成〔3〕。一系列研究发现海帕西啶表达还受骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的影响〔4〕，而BMP蛋白参与了骨骼形成过程，而钙离子是骨骼形成的基本离子之一。随着年龄相关的骨质疏松发生率增加的同时铁却出现沉积现象，这一系列结果说明铁内稳态可能与机体钙代谢之间存在密切联系。本实验探索小鼠腹腔注射不同阳离子后检测海帕西啶mRNA表达和血清铁的变化，以确定钙离子对机体铁内稳态的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂 实验用昆明雄性小鼠（清洁级）购自河北省实验动物中心〔合格证号:SCXK(冀)20031003〕，体重20 g左右；RNA提取试剂盒（Trizol试剂盒）、禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶、焦碳的二乙酯（DEPC）等均购自上海生工，其他试剂为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组与处理 16只小鼠分为4组，分别腹腔注射等渗的NaCl（0.154 mol/L）、MgCl2(0.103 mol/L)、CaCl2(0.103 mol/L)和FeCl3(0.077 mol/L)，每日1次，除FeCl3注射1 d（毒性太大，注射过多可导致死亡）外，其他均连续注射1 w。

　　1.2.2 取材 取材前12 h，小鼠禁食以减少肝糖原积累。腹腔注射0.4％戊巴比妥钠麻醉后，剖开腹腔，心脏取血以制备血清，然后使用DEPC处理后的生理盐水心脏灌流，完毕后取适量肝脏组织放入Trizol中进行RNA提取。

　　1.2.3 小鼠血清铁和总铁结合力测定 使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒按照说明书完成。

　　1.2.4 小鼠肝脏海帕西啶和β肌动蛋白（βactin）的mRNA RTPCR检测 将提取的RNA首先测定浓度，利用逆转录获得cDNA，然后对海帕西啶和βactin进行PCR 扩增22 个循环（94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min），将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，所得结果用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。实验中所用基因的PCR引物均为上海生工甗物工程技术有限公司合成，其序列分别为：海帕西啶：前向：5′CCTATCTCCATCAACAGATG3′；反向：5′AACAGATACCACACTGGGAA3′；βactin：前向5′AGCCATGTACGTAGCCATCC3′；反向：5′TTTGAGGTCACGCACGATTT3′。

　　1.3 统计学处理 数据资料用x±s表示，海帕西啶和βactin的mRNA相对含量（RTPCR后电泳吸光度比值并选取NaCl组为100）用柱形图显示，应用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 不同离子对小鼠血清铁和总铁结合力的影响 相对于NaCl组，注射MgCl2组可略升高血清铁含量，但差异不显著；而注射CaCl2组则使血清铁明显下降（P＜0.05）；注射FeCl3组则显著增加血清铁含量（P＜0.05）。计算表明，只有注射CaCl2组可明显减少转铁蛋白饱和度（P＜0.05），另外两种离子组则影响不显著（P＞0.05）。见表1。

　　表1 不同离子组对血清铁和总铁结合力的影响（略）

　　与NaCl组比较：1)P＜0.05，下图同

　　2.2 不同离子对小鼠肝脏海帕西啶mRNA表达的影响 利用RTPCR检测表明，相对于NaCl组，CaCl2组可显著抑制肝脏海帕西啶mRNA的表达（P＜0.05），FeCl3组则明显增加海帕西啶mRNA的含量（P＜0.05），而MgCl2组则影响不显著（P＞0.05）。见图1。

　　图1 不同离子对肝脏hepcidin mRNA表达的影响（略）

　　3 讨论
　　
　　海帕西啶作为一种铁调节激素肽，其对机体内稳态性维持具有十分重要的意义。海帕西啶本身还受到多种因素的调节，其中BMP6是重要的内源调节蛋白〔5〕，而BMP6的表达还受到铁的调节〔6〕，因此BMP6通过调节海帕西啶表达而参与体内铁平衡〔7〕。BMP家族成员大都与骨骼发育相关，其中BMP6本身参与了维生素D3和甲状旁腺素诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的钙化〔8〕，BMP6基因剔除小鼠表现出骨骼形成延迟同时伴随组织铁沉积，这意味着BMP6蛋白的缺乏造成铁吸收增多和钙吸收减少〔5〕。随着年龄增加，机体组织铁含量增加〔9〕，而同时骨质疏松发生率也增加，这一系列现象说明钙和铁代谢之间存在某种内在关联。
　　
　　本研究表明，机体钙离子增多可造成血清铁含量下降，这暗示着钙、铁离子存在一定的拮抗作用。已经研究发现，不同离子在吸收上存在密切关联，如锌离子可促进钙离子吸收〔10〕，本实验表明过多钙离子可抑制铁的吸收，而过多铁是否也抑制钙的吸收则需进一步证明。
　　
　　钙离子影响铁的吸收可能与调节海帕西啶mRNA表达有关。本研究显示，高钙可使肝脏海帕西啶mRNA表达明显减少，海帕西啶减少可使组织铁释放增加，以代偿机体的缺铁状况，这进一步说明过量钙离子可引起血清铁下降。因为血清铁降低可减少BMP6的表达〔6〕，从而达到减少海帕西啶表达的目的。王冰等〔11〕的研究表明骨质疏松模型中存在海帕西啶表达增加的现象，这说明钙铁代谢均与海帕西啶表达相关。
　　
　　总之，本实验初步确定了钙离子可通过调节肝脏海帕西啶的表达而影响铁代谢，进一步研究需确定其调节的详细分子机制，相关结果可能对部分钙或铁代谢紊乱疾病如老年人骨质疏松和铁沉积等的治疗具有重要意义。

参考文献

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　　3 Nicolas G，Chauvet C，Viatte L，et al.The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia，hypoxia，and inflammation〔J〕.J Clin Invest，2002；110(7):103744.

　　4 Camaschella C.BMP6 orchestrates iron metabolism〔J〕.Nat Genet，2009；41(4):3868.

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　　10 Kambe T，Weaver BP，Andrews GK.The genetics of essential metal homeostasis during development〔J〕.Genesis，2008；46(4):21428.

　　11 王 冰，徐又佳，马 勇，等.骨质疏松激素模型中肝脏铁调素基因表达变化的研究〔J〕.中国骨质疏松杂志，2008；14(5):299302.