cmyc、cfos mRNA及相关蛋白在糖尿病大鼠心肌细胞中表达的研究

　　　　　　 作者：纪征 尚小明 张燕 杨秀兰 李燕 李霞

【摘要】 目的 观察2型糖尿病状态下大鼠心肌细胞中cmyc、cfos mRNA及相关蛋白的变化。方法 50只雄性SD大鼠随机分为对照组（15只）和糖尿病组（35只）。对照组喂养标准饲料，糖尿病组喂养高脂饲料。喂养8 w后，检测空腹血糖、口服糖耐量试验、胰岛素抵抗指数（IRI）及血糖钳技术，证实糖尿病组大鼠产生了胰岛素抵抗。大鼠腹腔内注射STZ 25 mg/kg，血糖＞7.8 mmol/L为糖尿病大鼠模型，继续用高脂饲料喂养6 w。14 w时，用RTPCR方法检测两组大鼠心肌cmyc、cfos mRNA变化，用Western blot方法检测心肌相关cmyc、cfos蛋白变化。结果 高脂饲料喂养8 w时，糖尿病组空腹血糖高于对照组（P＜0.05）；IRI较对照组明显升高（P＜0.05）。14 w时，糖尿病组体重和空腹血糖高于对照组（P＜0.05），cmyc mRNA表达水平与对照组比较无显著性差异，cfos mRNA表达水平较对照组明显降低（P＜0.05），cmyc蛋白表达水平与对照组比较无显著性差异，cfos蛋白表达水平较对照组明显降低（P＜0.05）。结论 cmyc、cfos mRNA及其蛋白在糖尿病心肌中的表达可能存在时相性，cfos mRNA及其蛋白在糖尿病心肌病变的分子水平信号通路中异常表达，可能与糖尿病心肌病的发生发展相关。

【关键词】 糖尿病心肌病；细胞凋亡；增殖；cmyc；cfos

糖尿病心肌病是一种特殊类型的心肌病，凋亡在糖尿病心肌病变中起关键作用，糖化血清白蛋白能够增加早期反应基因cfos水平〔1～3〕，cmyc具有促进细胞凋亡的作用，cfos具有双重作用。但目前关于糖尿病心肌病变中cmyc、cfos mRNA及蛋白表达的报道较少，表达水平有无改变有待进一步阐明。本文着重探讨糖尿病状态下心肌细胞增殖和凋亡相关基因cmyc、cfos mRNA表达水平变化，及cmyc、cfos 相关蛋白水平的变化，探讨糖尿病大鼠心肌发生凋亡的分子生物学机制，为糖尿病心力衰竭的防治提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 8周龄雄性清洁级SD大鼠50只，体重200～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供（合格证编号：903200）。随机分为对照组（15只）及糖尿病组（35只）。对照组应用普通饲料喂养（碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%），糖尿病组应用高脂饲料喂养（碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质20.1%）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 仪器与试剂 低温冰箱（日本SANYO公司），GHK2FGS显微镜（日本Olympus公司），制冰机（日本SANYO公司），血糖/血酮仪OptiumTM（美国强生公司），低温高速离心机HITACHI20PR52D（日本东芝公司），HM315组织切片机（德国Walldorf公司），Humalyzer半自动生化仪（德国豪迈公司），光镜照相机MICRODPHOTFXA（日本Nikon公司）。链脲佐菌素（STZ，德国SERVA公司），RT试剂盒（Fermentas公司），PCR试剂盒（ Promega公司）。

　　1.2.2 模型制备 参照文献〔4～6〕方法建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型。两组大鼠饲养8 w后，对照组及糖尿病组各随机抽取5只大鼠，通过空腹血糖测定、口服糖耐量试验（OGTT）、空腹胰岛素水平（FINS）、胰岛素抵抗指数（IRI）及血糖钳技术证实糖尿病组大鼠产生了胰岛素抵抗。其余20只糖尿病组大鼠禁食12 h后一次性腹腔内注射小剂量2%STZ 25 mg/kg，注射72 h后尾静脉采血，测定禁食6 h后的空腹血糖，血糖＞7.8 mmol/L为2型糖尿病大鼠模型，继续用高脂饲料喂养6 w。

　　1.2.3 检测指标 动物饲养8 w，空腹12 h后，用50％葡萄糖灌胃(2 g/kg)，割尾取血，用OptiumTM血糖/血酮仪按常规快速测定仪检测0、30、60、120 min血糖。FINS采用竞争性放射免疫分析法测定，放射性125I胰岛素同样品中的胰岛素抗体竞争反应，按常规操作进行。正葡萄糖钳夹实验测定胰岛素敏感性，记录稳态下连续120 min的葡萄糖输注速率。取稳态下6 次葡萄糖输注速率的平均值作为稳态葡萄糖输注速率〔GIR， mg/(kg·min)〕，反映机体对胰岛素的敏感性。参照文献〔7，8〕方法，依据公式〔IRI=(FBG×FINS)/22.5〕计算IRI值。

　　1.2.4 cmyc、cfos mRNA表达的测定 14 w时，大鼠禁食12 h，次日6 ml/kg乌拉坦腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔取出心脏，剪去血管和心脏周围结缔组织，用4℃预冷生理盐水冲洗，立即置于液氮中，分装后-80℃冻存，用于提取总RNA。用Trizol法提取总RNA，应用上海生工生物工程公司的PCR引物：cmyc（GenBank：AY679730）：上游：5′CTTCCCCTACCCGCTCAACGAC3′，下游：5′CACATCAATTTCTTCCTCATCA3′，扩增产物长度为208 bp；cfos(GenBank:X06769)：上游：5′CTTCCTTTGTCTTCACCTACCC3′，下游：5′GGCTCACATGCTACTAACTACC3′，扩增产物长度为439 bp；GAPDH(GenBank:AF106860)：上游：5′ACATCATCCCTGCATCCACT 3′，下游：5′GGGAGTTGCTGTTGAAGTCA 3′，扩增产物长度为650 bp。以GAPDH作为内参照，以RTPCR方法检测cmyc、cfos mRNA的相对表达量。

　　1.2.5 cmyc、cfos蛋白的测定 应用蛋白质提取液提取心肌组织中的总蛋白，以βactin作为内参照，采用Western印迹方法测定cmyc、cfos蛋白的变化。

　　1.3 统计学处理 所有数据均用x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理分析，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析检验。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 对照组大鼠进食饮水状况、日常活动、精神状态等正常。糖尿病组大鼠体重明显增加，呈现腹型肥胖，8 w时明显重于对照组。注射STZ后，体重下降，但至14 w时，体重仍然重于对照组。糖尿病组大鼠在注射STZ后1 w内出现多食、多饮、多尿症状，并逐渐加重，毛发干枯，色泽晦暗，反应迟缓，活动量明显减少。

　　2.2 体重及FINS、FPG、ISI水平 见表1～表5。8 w时，OGTT试验糖尿病组各个时间点血糖值均高于对照组（P＜0.05）。糖尿病组大鼠体重和血糖钳GIR与对照组比较有显著性差异（P＜0.05），体重增加，GIR明显减低，表明糖尿病组大鼠出现明显的胰岛素抵抗。糖尿病组空腹FINS、FBG、ISI明显高于对照组（P＜0.05）。注射STZ后72 h，空腹血糖糖尿病组大鼠显著高于糖尿病组注射STZ前(P＜0.01)。14 w时，糖尿病组大鼠体重和空腹血糖高于对照组（P＜0.05）。

　　表1 8 w时两组大鼠OGTT试验各时间点血糖浓度（略）

　　与对照组比较：1）P＜0.05，下表同

　　表2 8 w时两组大鼠体重和葡萄糖钳夹试验GIR（略）

　　表3 8 w时两组大鼠FINS、FPG和ISI（略）

　　表4 糖尿病组注射STZ与糖尿病组未注射STZ 3 d后FPG水平（略）

　　表5 14 w时两组大鼠FPG水平（略）

　　2.3 糖尿病状态下心肌细胞cmyc、cfos mRNA的表达 见图1～图3。以GAPDH作为内参照，cmyc mRNA的相对表达量在208 bp处可见明显条带，密度扫描对照组为0.390 9±0.112 9，糖尿病组为0.381 6±0.044 8，两组无显著性差异。 cfos mRNA的相对表达量在439 bp处可见明显条带，密度扫描对照组为0.509 6 ±0.125 4，糖尿病组为0.395 2±0.067 4，组间比较有统计学差异（P＜0.05）。

　　图1 28 s和18 s RNA的RTPCR分析（略）

　　图2 RTPCR 14 w时糖尿病状态下cmyc mRNA的变化（略）

　　图3 RTPCR 14 w时糖尿病状态下cfos mRNA的变化（略）

　　图4 Western印迹法14 w时糖尿病状态下cmyc蛋白表达的变化（略）

　　图5 Western 印迹法14 w时糖尿病状态下cfos蛋白表达的变化（略）

　　2.4 糖尿病状态下心肌细胞cmyc、cfos蛋白的表达 cmyc蛋白的相对表达量 Western结果显示27 kD处有一个条带，密度扫描正常对照组为0.391±0.113，糖尿病组为0.382±0.045，两组无显著性差异。cfos蛋白的相对表达量 Western结果显示40 kD处有一个条带，密度扫描对照组为0.510±0.125，糖尿病组为0.395±0.067（P＜0.05）。

　　3 讨论
　　
　　糖尿病大鼠胰岛素受体浓度增加，胰岛素活化的受体酪氨酸磷酸化增加，尽管IRS1的浓度减少，但是IRS1酪氨酸磷酸化增加，从而使磷脂酰肌醇3磷酸激酶活性减弱。由于胰岛素抵抗使磷脂酰肌醇3磷酸激酶的活性处于下降通道，胰岛素活化的糖原合成明显减少。胰岛素活化的心肌cfos mRNA水平增加，因此胰岛素信号通路的早期信号方向改变〔9〕。在新生的心肌细胞，胰岛素缺乏导致细胞凋亡，此效应与PI3激酶/Akt信号通路受损和bcl/bax比率降低有关，细胞内活性氧明显增加，导致线粒体DNA氧化受损，组成电子传递链的线粒体编码蛋白的表达受损〔10〕。核心2G1cNAc转移酶（core2 G1cNAcT）是O连接多聚糖生物合成途径的调节酶，在糖尿病动物心肌中明显增高，并受高糖和胰岛素的调节。过度表达core2 G1cNAcT的转基因大鼠表现出明显的心肌肥厚，唾液酸O聚糖增加，cfos基因表达增加，AP1活性增加，均为心脏应激的特征〔11〕。 在高糖刺激下，糖化血清白蛋白（GSA）平行诱导激活平滑肌细胞（VSMCs）的氧化还原反应转录因子（核因子κВ）和AP1，并增加MAPKs、细胞外信号调节蛋白（ERK）、p38MAPK的活性。GSA能够明显刺激VSMCs的增殖和迁移，引起血管壁炎症介导因子的产生，导致VSMCs 的增殖和迁移〔12〕。因此，糖尿病心肌病变自始至终存在着基因水平的表达异常，尤其是心肌细胞凋亡，细胞凋亡是由基因调控的主动死亡过程，具有独特的形态结构、生化和细胞分子生物学特征，在糖尿病心肌病变和心脏重构过程中起重要作用，是多基因多因素影响的结果。但目前糖尿病心肌病变中，cmyc、cfos mRNA及蛋白在糖尿病心肌中的表达的报道较少。肿瘤坏死因子α（TNFα）激活MAPK，使bax表达上调，bcl2表达下调，引起细胞凋亡；TNFα促进cfos、cmyc表达，使心肌产生收缩功能不良的胚胎型同工蛋白，心肌间质胶原纤维沉积和心肌间质纤维化。
　　
　　本研究发现，在糖尿病心肌中，诱导凋亡的基因cmyc mRNA及蛋白表达水平无明显变化，具有促进分化和诱导凋亡双重作用的cfos mRNA及蛋白表达水平下降。cfos mRNA及蛋白表达与其他研究结果不同，多数研究为表达增高，提示cfos mRNA及蛋白表达可能在糖尿病心肌病变的发生发展过程中存在时相性的特点，尚有待进一步深入研究。
　　
　　综上，cmyc、cfos mRNA及蛋白表达在糖尿病心肌病变的发生发展过程中可能存在时相性的特点，cfos mRNA及其蛋白在糖尿病心肌病变的分子水平信号通路中异常表达，可能与糖尿病心肌病的发生发展相关。

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