雌激素对老年雌鼠阴道NOS及雌激素受体的影响

　　　　　　作者：饶婷 张孝斌 吴飞 程帆 葛名欢 袁友光

【摘要】 目的 研究雌激素对老年雌性大鼠阴道组织一氧化氮合酶（NOS）活性及雌激素受体（ER）亚型的影响，探讨雌激素作用于女性性功能的可能机制。方法 SD雌性大鼠分三组：青年组（3月龄）、老年组（20月龄）、苯甲酸雌二醇治疗组，比色法检测阴道组织NOS的活性，免疫组化法检测ER α和β的表达。结果 老年大鼠阴道NOS活性下降，而阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ表达增加，雌激素治疗能逆转这些变化。大鼠血清雌二醇浓度与阴道组织NOS活性呈正相关，两者均与阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ呈负相关，而与大鼠阴道上皮细胞ERβ、基质纤维细胞ERα和ERβ无相关性。结论 雌激素可以通过调节阴道NOS维持女性性功能，这一过程与阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ密切相关。

【关键词】 雌激素；女性性功能障碍；一氧化氮合酶；雌激素受体

伴随老龄化和绝经期的到来，血雌激素水平下降，女性性功能障碍（FSD）发生率显著增加〔1，2〕，严重影响着女性生活质量。雌激素是维持女性性反应的重要内分泌因素，但其具体机制仍不清楚。近来研究发现，硝普钠和左旋精氨酸可促进兔阴蒂海绵体平滑肌的舒张〔3〕；在人体中，西地那非能增加阴蒂动脉血供，改善女性性唤起、性高潮和性快感等FSD问题〔4〕。因此，与男性勃起功能机制类似，由一氧化氮合酶（NOS）催化L精氨酸生成的一氧化氮（NO）在女性性反应机制中亦有着重要作用。由此推测雌激素对女性性功能的调节机制中，NO为重要的中间环节，但雌激素如何调节NO进而维持女性性反应，尚需实验探讨。已知雌激素通过雌激素受体（ER）介导其生物效应，ER分为ERα和ERβ两种亚型，广泛分布于全身各部位，本研究通过观察雌激素对雌性大鼠阴道组织NOS活性及ER亚型的影响，探讨雌激素维持女性性反应的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 成年雌性SPF级SD未生育大鼠30只购于武汉大学动物实验中心，随机分为3组：青年组（3月龄）10只，肌肉注射麻油0.1 ml；老年组（20月龄）10只，肌肉注射麻油0.1 ml；雌激素治疗组10只，20月龄老年大鼠肌肉注射生理剂量1 mg/kg苯甲酸雌二醇。药物注射隔日一次，共30 d。苯甲酸雌二醇由上海第九制药厂生产，用麻油稀释。

　　1.2 大鼠血清17β雌二醇水平放射免疫测定 用药30 d后，大鼠以水合氯醛麻醉，心脏穿刺取血2 ml以3 000 r/min离心5 min后将血清移入EP管，-20℃保存，用放射免疫荧光法（试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司）统一测定雌激素。

　　1.3 NOS活力的检测 取一定量新鲜标本，称重加9倍重的生理盐水制备成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min；按试剂盒说明书操作，取上清液200 μl测NOS活力（NOS测定试剂盒，南京建成生物工程研究所），10 μl测蛋白含量（BCA蛋白浓度测定试剂盒，武汉博士德生物有限公司）。NOS催化L精氨酸和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色物，在530 nm的波长下测定吸光度，根据吸光度的大小可以计算出NOS活力。

　　1.4 免疫组织化学染色 阴道组织10%中性甲醛固定，石蜡包埋。采用链霉卵白素过氧化物酶法(SP法) 检测大鼠阴道组织ERα/β水平。一抗为兔多克隆抗体ERα（Santa Cruz Biotechnology，1∶100）和兔多克隆抗体ERβ（Upstate，1∶50），二抗为羊抗兔IgG。SP试剂盒和浓缩型DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。用ImageproPlus图像分析系统分析阳性染色结果，每张切片随机观察5个视野，测其平均光密度值（OD值）。

　　1.5 统计学方法 数据以x±s表示，统计处理采用SPSS13.0统计软件，单因素方差分析和直线相关分析。

　　2 结果

　　2.1 大鼠血清17β雌二醇含量 老年组血清17β雌二醇含量为(13.81±5.11)pg/ml，显著低于青年组(33.70±11.99)pg/ml和雌激素治疗组(34.32±7.47) pg/ml(P＝0.000)。

　　2.2 大鼠阴道NOS活性 老年组阴道NOS活性为(4.17±1.81)U/mg·prot，显著低于青年组(10.68±2.0)U/mg·prot和雌激素治疗组(11.07±2.36)U/mg·prot(P＝0.000)。相关分析显示，大鼠阴道NOS活性与血清雌二醇浓度呈正相关（r＝0.798，P＝0.000）。

　　2.3 大鼠阴道ERα和ERβ免疫组化染色结果 两种ER亚型在阴道组织中均有表达，在ERα免疫组化切片中，棕黄色颗粒主要位于细胞核内；在ERβ免疫组化切片中，棕黄色颗粒主要位于细胞浆内。两种受体均可见表达于鳞状上皮细胞、平滑肌细胞以及基质纤维细胞，其中鳞状上皮细胞以ERα表达为主，ERβ表达较弱，平滑肌细胞中ERβ表达较ERα表达略占优势，基质纤维细胞中两种受体表达均较弱。见图1。老年雌鼠阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ表达增加，而上皮细胞ERβ、基质纤维细胞ERα和ERβ无明显改变，雌激素治疗使阴道ER两种亚型表达均下调。阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ与大鼠血清雌二醇浓度及阴道组织NOS活性呈负相关（P＜0.01）。而雌鼠阴道上皮细胞ERβ、基质纤维细胞ERα和ERβ与血清雌二醇浓度、阴道组织NOS活性无明显相关性（P＞0.05）。见表1。

　　表1 各组大鼠阴道组织ERα和ERβ OD值（略）

　　与同组织ERβ相比：1)P＜0.01；与青年组相比：2)P＜0.01；相关分析：3)P＜0.01

　　图1 大鼠阴道ERα和ERβ免疫组化染色结果（×200）（略）

　　3 讨论
　　
　　女性生理性性唤起反应依赖于阴唇、阴蒂敏感性的增加及阴道和血管平滑肌的舒张，后者引起血管充血，阴道腔渗出液增加。随着绝经后女性阴道内环境的生理性变化，FSD发病率显著增高，说明雌激素水平直接影响女性性功能。研究发现女性性刺激时NOS催化非肾上腺素能/非胆碱能（NANC）神经递质NO的合成，后者进而刺激环磷酸鸟苷形成，能导致细胞内钙离子浓度下降而使阴道和血管平滑肌舒张〔5〕。本实验结果显示，老年大鼠阴道NOS活性明显下降，补充雌激素能升高大鼠阴道NOS活性，提示雌激素可通过调节NOS活性而维持女性性反应，这一结果支持Berman等〔6〕的观点。Yoon等〔7〕研究认为，由于代偿生殖器平滑肌/胶原比值降低，雌兔去卵巢后阴蒂和阴道组织NOS活性及nNOS和eNOS表达增强，雌激素替代治疗下调NOS。推测可能实验动物种类不同，其NOS的组织分布及受雌激素的影响亦不同。
　　
　　ER是由配体活化的转录因子，通过与靶基因上特异性效应元件结合，调节靶基因的表达。两种ER亚型分布不同，与雌激素亲和力不同，具有不同的生物学功能。免疫组化结果显示，大鼠阴道各组织细胞均存在ERα和ERβ表达，其中鳞状上皮细胞以ERα表达为主，ERβ表达较弱，平滑肌细胞中ERβ表达较ERα表达略占优势，基质纤维细胞中两种受体表达均较弱。说明两种ER亚型均参与介导雌激素对大鼠阴道NOS的生物学效应，但ERα和ERβ存在一定的组织及细胞分布的特异性，两种受体亚型的表达水平不同可能就是一些组织对雌激素及雌激素受体调节剂的反应不同的原因所在。并且，去势使大鼠阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ表达代偿性增加，补充雌激素后下降；相关分析显示，大鼠阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ与血清E2浓度及阴道组织NOS活性呈负相关；而大鼠阴道上皮细胞ERβ、基质纤维细胞ERα和ERβ的表达，在大鼠去势后无明显改变，补充雌激素后下调，与大鼠血清E2浓度、阴道组织NOS活性无明显相关性，说明不同细胞两种ER 亚型的表达随雌激素水平的变化不同，阴道组织对雌激素的反应可能取决于ER总量以及两种ER亚型各自的表达水平和形成的同源或异源二聚体的比例〔8〕。推测雌激素主要通过阴道上皮细胞ERα、平滑肌细胞ERα和ERβ介导对阴道黏膜上皮及平滑肌的生物效应，促进阴道NOS增加，平滑肌舒张，阴道黏膜分泌增加，在女性性反应中起到一定作用。提示阴道黏膜上皮及平滑肌的ER亚型的表达情况有可能成为临床评估女性性功能的一项客观指标。但ER在人类阴道组织中两种亚型的具体生物学功能及两者之间的关系仍有待进一步研究。
　　
　　雌激素调节女性性功能的机制复杂，NOS催化的NO在其中起着不可忽视的“桥梁”作用，因此，5型磷酸二酯酶抑制剂在FSD的治疗上有良好的前景。并且，为避免临床上长期应用雌激素的风险，了解ER亚型在阴道中的不同生物功能将为选择性雌激素调节剂应用与FSD开辟新的途径。但本实验方法不能鉴别NOS亚型，NOS亚型受雌激素的影响及其与ER亚型之间的生物学效应尚需进一步研究。

参考文献

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　　2 Sidi H，Puteh SE，Abdullah N，et al.The prevalence of sexual dysfunction and potential risk factors that may impair sexual function in Malaysian women〔J〕.J Sex Med，2007；4(2)：31121.

　　3 Pohanka M，Kanovsky P，Bares M，et al.Pergolide mesylate can improve sexual dysfunction in patients with Parkinson′s disease：the results of an open，prospective，6month followup〔J〕.Eur J Neurol，2004；11(7)：4838.

　　4 PadmaNathan H，Brown C，Fendl J，et al.Efficacy and safety of topical alprostadil cream for the treatment of female sexual arousal disorder (FSAD):a doubleblind，multicenter，randomized，and placebocontrolled clinical trial〔J〕.J Sex Marital Ther，2003；29(5)：32944.

　　5 Min K，O′Connell L，Munarriz R，et al.Experimental models for the investigation of female sexual function and dysfunction〔J〕.Int J Impot Res，2001；13(3)：1516.

　　6 Berman JR，Mc Carthy MM，Kyprianou N.Effect of estrogen withdrawal on nitric oxide synthase expression and apoptosis in the rat vagina〔J〕. Urology，1998；51(4)：6506.

　　7 Yoon HN，Chung WS，Park YY，et al.Effects of estrogen on nitric oxide synthase and histological composition in the rabbit clitoris and vagina〔J〕. Int J Impot Res，2001；13(4)：20511.

　　8 Kuiper GG，Enmark E，PeltoHuikko M，et al.Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1996；93(12)：592530.