作者：郭卿，江浩，沈学明，彭开桂，汪庚明，何斌
【摘要】 近年来，肿瘤的生物治疗逐渐得到重视，其中备受关注的领域之一就是血管抑制剂的应用。人类凝血酶敏感蛋白-1（tThrombospondin 1，TSP-1）的1型重复序列（three thrombospondin-1 type 1 repeats，3TSR，TSRs）是从TSP-1中提纯的抗血管生成的功能结构域。3TSR作为一种较新的抗新生血管形成因子，保留了TSP-1 抑制新生血管形成的功能， 同时很大程度上降低了TSP-1其他功能引起的副作用。它可能通过诱导内皮细胞凋亡抑制新生血管生成。
【关键词】 血管生成抑制因子；3TSR；肿瘤
Abstract: For the past few years， anti-angiogenic factors showed potent therapeutic effect on cancer by inhibiting tumor angiogenesis and may prove to be a promising agent for clinical cancer treatment. 3TSR (three thrombospondin-1 type 1 repeats) is an anti-angiogenic domain， purified from human thrombospondin-1 (TSP-1). As a relatively new anti-angiogenic factor， 3TSR retained the function of inhibiting the angiogenesis of TSP-1， while it largely reduced the side effects caused by other functions of TSP-1. 3TSR may inhibit angiogenesis by inducing endothelial cell apoptosis.
Key words: angiogenesis inhibitor; 3TSR; neoplasms
人类凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）是抗新生血管形成、抑制肿瘤生长的天然三聚体高分子糖蛋白［1］，对实体瘤具有一定治疗作用，但是大剂量应用存在不少副作用，使得临床应用受到了限制。由TSP-1提纯而来的TSP-1的1型重复序列（3TSR）能够发挥与TSP-1相同的抗新生血管生成功能而且副作用相对较少［2-3］。
1 3TSR蛋白特征
1.1 3TSR的结构
3TSR是1993年由美国华盛顿大学医学院和美国西北大学医学院的Tolsma等［4］提出，由哈佛医学院Beth Isreal Deaconess 医学中心病理实验室提纯的人类TSP-1抗血管生成的功能结构域。TSP-1属于黏附糖蛋白家族，相对分子质量为450×103，是由3条相同肽链构成的同源三聚体基质分泌类糖蛋白，每条肽链由N端、C端球状结构域、原胶原同源区、type1、type2和type3重复序列组成。由血小板活化前释放，是血小板α粒子的重要组成部分之一。其中type1重复序列 (thrombospondin type1 repeats，TSRs，3TSR)由3个备解素样基序(TSR1、TSR2、TSR3)组成。
1.2 3TSR的功能
3TSR能够发挥与TSP-1相同的抗新生血管生成功能而且副作用相对较少。
增加TSP-1的分泌能够抑制前列腺癌组织中血管的生成，表明TSP-1存在抑制肿瘤生长作用［5］。当转染后过度表达TSP-1，人类癌细胞（前列腺癌和皮肤鳞状细胞癌）在裸鼠体内增长率更低，并且微血管密度明显减少。TSP-1用于人黑色素瘤和结肠癌移植瘤的治疗中，能够显著减少肿瘤体积和微血管的密度［6］。
然而，TSP-1是一个复杂的高分子，有许多其他的受体，因此会产生很多相应的副作用，使其临床使用的可能性降低，难以大规模生产。例如，血浆TSP-1与肾间质纤维化呈正相关［2］。TSP-1、抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体及可溶性血管内皮生长因子受体会引起纤维化心肌重塑、急性肾小球内皮细胞分离、肥大和蛋白尿［2-3］。
3TSR是TSP-1的功能结构域，抗肿瘤的能效涉及抑制血管生成和刺激转化生长因子（TGF-β）表达。通过结合跨膜受体CD36，3TSR抑制其游走并且诱导微血管内皮细胞凋亡，从而抑制血管生成，是抗血管生成的有力调节剂［1］。因为抗血管生成和TGF-β序列（KRFK）的激活都是位于3TSR内［7］，3TSR 能够明显抑制胰腺癌的生长及血管的生成，而且抑制肿瘤的远处转移［8］。
1.3 3TSR的分布
3TSR在正常的成人组织中分布很少，但在炎症和损伤过程中大量表达。例如，它积聚于动脉粥样硬化内膜，可能会在此刺激血管平滑肌细胞增殖和迁移并且增强对血小板衍生生长因子的反应性［9］。
2 3TSR抑制肿瘤的机制
2.1 抑制内皮细胞迁移和诱导细胞凋亡
据报道，这些效应是由3TSR结合CD36受体在内皮细胞细胞膜上的相互作用介导［10］。TSP-1受体结合CD36的顺序是首先激活p59fyn、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）和p38丝裂原活化蛋白激酶，然后导致微血管内皮细胞凋亡。然而，如果没有CD36序列和TSRs衍生肽的结合，后者仍然有抗血管生成的功能，表明3TSR通过多个位点以及不同的机制抑制血管生成［7］， 3TSR和TSP-1抑制内皮细胞迁移的浓度水平相似。在体外，3TSR也能以依赖CD36的方式诱导内皮细胞凋亡，而且不论3TSR是体内还是体外的凋亡途径诱导凋亡，都要激活caspase-3。此外，3TSR减少内源性和血管内皮生长因子诱导的c-丙氨酸氨基转移酶检测(c-alanine aminotransferase assav， c-Akt)活性并通过表达VEGF诱导内皮细胞凋亡。通过3TSR的治疗，肿瘤内血管内皮细胞凋亡的增加和肿瘤微血管密度的减少，提示外源性3TSR减少胰腺肿瘤血管形成的微环境并诱导血管内皮细胞凋亡，从而显著抑制肿瘤血管生成［8］。
2.2 血管内皮生长因子
由于VEGF的生理水平是保持血管内皮细胞动态平衡的关键，针对胰腺癌的抗血管生成治疗，它可能有促进低剂量抗VEGF抗体与其他介质如TSP-1/3TSR结合的作用，是促进血管生成和保持血管通透性的标志性刺激物。而TSP-1是一种强有力的血管生成抑制剂，与抗血管生成有关的受体的聚集可能为内皮细胞提供了一个在细胞膜上整合促进和抑制信号的平台。因此，这个复杂的结构可能是一种分子开关，调节抗血管生成作用并决定血管内皮细胞状态。TSP-1已被证明是由RAS系统介导的血管生成开关的关键因素，在胰腺癌中有75％至100％的突变概率［11］。此外，TSP-1和抗血管内皮生长因子小干扰RNA的协同作用已经在鼠纤维肉瘤模型中得到证实［12］。
2.3 与CD36和CD47相互作用
CD36对于有些抑制血管生成的母细胞糖蛋白TSP-1是不可或缺的，因此将CD36假定为受体调节3TSR的抗血管生成活性。CD36与3TSR结合可以抑制一氧化氮信号表达，但需要CD47的参与。在一氧化氮刺激下，CD47是3TSR必不可少的抑制性受体，CD36片段若要充分调解继发的抑制反应，也需要CD47的参与。在不含CD47或者不含TSP-1的血管细胞中，基础cGMP的水平都升高，但在不含CD36动脉平滑肌细胞中没有观察到基础cGMP升高。因此，内源性TSP-1抑制基础cGMP水平的能力需要的是CD47而不是CD36。在角膜内，CD36抗体镶嵌在TSP-1内发挥抑制作用，而当受到一氧化氮刺激后，CD36抗体本身亦能够抑制血管生成。另外，CD47与CD36之间的交叉干扰，可能发生在质膜［13］。
2.4 与G207作用
感染U87和U373细胞呈减少蛋白质、无mRNA、表达TSP-1和凝血酶-2（TSP-2）。在受感染的肿瘤，这些增加的血供是通过减少TSP-1和TSP-2的水平介导的，并且导致迟发肿瘤的发生。当G207与3TSR结合治疗肿瘤，可减少微血管密度和妨碍肿瘤生长的恢复［14］。
2.5 一氧化氮
3TSR在1×10-10mol/L时就能明显的抑制一氧化氮支配细胞的黏附作用，与原生TSP-1活性相当。同样，一氧化氮刺激细胞内cGMP积聚的作用也被3TSR显著抑制［15］。
2.6 促进巨噬细胞聚集
TSP-1抑制肿瘤生长一般归功于其具有抗肿瘤血管生成活性，但对肿瘤免疫的影响也应考虑。在移植黑色素瘤的裸鼠体内，瘤细胞中3TSR表达的增加会引起巨噬细胞聚集。在体外，3TSR通过单核细胞诱导纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）表达的能力很强，这表明3TSR诱导的巨噬细胞聚集至少部分由PAI-1介导。肿瘤相关巨噬细胞可以促进也可以限制肿瘤的发展。激活潜在的TGF-β是由3TSR所介导［16］。
2.7 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肿瘤细胞坏死
TRAIL受体2激动剂抗体和3TSR结合能显著增强和延长肿瘤抑制作用。3TSR在调节凋亡信号转导通路中起关键作用，控制内皮细胞生长和死亡。TRAIL结合3TSR抗肿瘤和肿瘤相关血管，对肿瘤来说是双重打击［17］。
2.8 腺相关病毒介导的3TSR和内皮抑素相结合的治疗能够抑制全身和局部的肿瘤血管的生成 在体内，腺相关病毒载体表达的3TSR和内皮抑素有显著抗血管生成的功效［18］。
3 3TSR与肿瘤的可能关系
3.1 3TSR与胰腺癌
3TSR治疗大大降低血管生成和原位胰腺癌瘤体的生长。
3.1.1 在体实验研究
3TSR治疗的老鼠的肿瘤体积减少69％，而且显著增加肿瘤坏死面积。3TSR治疗后，微血管密度从8.0％下降至3.7％，肿瘤血管内皮细胞凋亡率由4.2％提高到14.7％。研究发现，通过3TSR的治疗，肿瘤血管内皮细胞凋亡率增加了3.5倍。经过3周系统性3TSR治疗后肿瘤体积与使用磷酸盐缓冲液治疗后肿瘤体积相比减少了69％，与对照组肿瘤相比，3TSR治疗后的肿瘤出现大面积坏死，在肿瘤中心的切片中，未经过3TSR治疗的平均肿瘤坏死面积为25.9％，经过3TSR治疗后，平均肿瘤坏死面积明显增加至51％。肿瘤坏死的增加可能是3TSR导致肿瘤缺血、微血管密度下降的结果［8］。在小鼠体内，3TSR诱导肿瘤内皮细胞凋亡。在研究的肿瘤中，凋亡的内皮细胞基础水平为4.2％，而在接受3TSR治疗后肿瘤血管内皮细胞的细胞凋亡水平达到14.7％。经过3TSR的治疗，在种植肺癌的小鼠体内血管内皮生长因子刺激血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）磷酰化表达也显著降低［10］。
3.1.2 体外实验研究
3TSR有显著抗血管生成和抗肿瘤的疗效。在体外细胞培养中发现，3TSR显著降低VEGF刺激人皮肤微血管内皮细胞VEGFR2磷酸化。结果表明，TSP-1和3TSR都能够调节VEGFR2的功能［10］。
3.1.3 3TSR相关实验的数据
在体内或者体外，3TSR对胰腺癌细胞的增殖、凋亡无直接影响， 虽然可通过TSP-1-CD36的相互作用诱导白血病细胞凋亡，但是这个有效的内皮细胞凋亡途径在大部分实体瘤中都不存在。研究表明，6个胰腺癌细胞株均未检测到CD36的表达［8］。TGF-β是调节3TSR功能的另一个下游因子。在人胰腺癌，TGF-β及其受体和其细胞内效应器SMAD蛋白经常变异或改变表达水平，而且AsPC-1细胞既不表达TGF-β的2型受体，又不表达SMAD4基因［19］。因此，可以想象，3TSR不能直接作用于胰腺癌细胞因其缺乏效应分子。
3.2 3TSR与胃癌
蒋平等［20］研究证实，3TSR能抑制裸鼠胃癌新生血管形成，显著减少肿瘤体积、肿瘤血管和增加肿瘤细胞坏死，但对胃癌细胞无直接抑制作用，其机制可能与诱导内皮细胞凋亡有关。
3.3 3TSR与胆囊癌
金洲祥等［21］的研究表明3TSR显著减少肿瘤体积，抑制微血管生成。3TSR与化疗药物5-Fu合用对胆囊癌的治疗有协同作用。
4 3TSR对相关肿瘤的治疗
最近的研究表明，在原位胰腺癌模型，不断降低剂量给药并改进治疗效用，3TSR能够以小型渗透泵形式放置在体内至少7天，其生物学功能还很稳定。 通过使用不同剂量和方式，证明了3TSR抗肿瘤疗效与抗血管生成疗效相关。3TSR治疗减少肿瘤血管开放和血流通畅［22］。
当3TSR与化疗方法相结合处理肿瘤靶细胞时，会产生更有效的作用。TSP-1和伊替立康结合在结肠癌模型中显示更强的抗肿瘤效果［23］。
原发肿瘤手术切除后，腺相关病毒介导的3TSR和内皮抑素抗血管生成介质可以通过肌注和瘤内注射的方式治疗晚期胰腺癌放疗患者。极有希望作为胰腺癌及其他胃肠道肿瘤患者的治疗方案［18］。
5 问题与展望
目前，有关3TSR的文献总体还不多，但其研究结果均已显示出该因子具有明显抗肿瘤生长和抑制血管生成功能。研究工作主要集中在该因子对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用和机制方面。然而，肿瘤细胞中的基因变化，有可能使它们克服血管生成抑制剂的作用，这是临床上要关注的问题，特别是针对长期抗血管生成的治疗。可以预期，3TSR作为抗血管生成药物具有良好的应用前景。
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