TNFα308位点基因多态性与环境因素在肝癌发生中的交互作用

　　　　　　 作者：宋韶芳，郜艳晖，陈思东

【摘要】 　　目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)α308位点基因多态性与环境因素在肝癌发生中的交互作用。方法 应用1∶1配对病例对照的研究方法，对广东顺德地区81例原发性肝癌进行危险因素调查。用ELISA检测HBV感染5项指标、丙肝抗体、甲胎蛋白、肝吸虫抗体；PCRRELP分析TNFα308位点。应用条件Logistic回归模型筛选出肝癌发生的环境及遗传危险因素。根据交互作用指标判断基因与环境的交互作用。结果 HBsAg、肝病史、饮酒、TNF2等位基因是广东顺德居民肝癌的危险因素。HBsAg与TNF2等位基因存在交互作用：其OR值为19.83(95%CI:4.20～93.61)；超相对危险比（RERI）、交互作用归因比（API）、两因素交互作用指数（SI）分别为14.39、0.73、4.23。肝病史与TNF2等位基因存在交互作用：其OR值为7.63(95%CI:1.05～67.71)；其RERI、API、SI分别为2.22、0.29、1.50。饮酒与TNF2等位基因存在交互作用：其OR值为4.57(95%CI:1.62～12.88)；其RERI、API、SI分别为1.39、0.30、1.63。结论 肝癌的发生是环境及遗传危险因素综合作用的结果，TNF2等位基因与HBsAg、饮酒、肝病史在肝癌发生中存在一定的交互作用。

【关键词】 原发性肝癌 肿瘤坏死因子α 基因多态 交互作用

　　Abstract:Objective To study the interaction of the environmental risk factors and the genetic polymorphisms of the human tumor necrosis factorα308 position in primary liver cancer(PLC). Methods A casecontrol study was conducted in Shunde， Guangdong. Epidemiological data about environmental exposure of 81 cases and controls were collected， using ELISA to detect HBV， HCV， AFP， liver fluke and PCRRELP technology to analyze TNFα308 position. Results Conditional logistic regression (CLR) was conducted to explore risk factors of PLC， and it is indicated that hepatitis B， alcohol consumption， liver disease history， and carriage of TNF2 allele were associated with increased risks of PLC．HBsAg was interacted with the TNF2 allele during the generation of PLC， with the OR=19.83 (95%CI:4.20-93.61); and their RERI， API， SI were 14.39， 0.73，and 4.23 respectively. Liver disease history was interacted with the TNF2 allele during the generation of PLC， with the OR=7.63 (95%CI:1.05-67.71)， and RERI， API， SI were 2.22， 0.29，and 1.50 respectively. Alcohol consumption was interacted with the TNF2 allele during the generation of PLC， with the OR=4.57(95%CI:1.62-12.88)， and RERI， API， SI were 1.39， 0.30，and 1.63 respectively. Conclusion The study indicated that risk factors of PLC， i.e， hepatitis B， alcohol consumption， liver disease history， and carriage of the TNF2 allele were associated with increased risks of PLC; and the TNF2 allele was interacted with HBsAg， liver disease history， and alcohol consumption.

　　Key words:primary liver cancer;human tumor necrosis factorα;genetic polymorphism;interaction effect

　　肝癌的发生受多种因素的影响，依其来源、性质与作用方式的差异，可分为外源性因素与内源性因素。在发达国家，丙肝病毒(HCV)和酗酒是肝癌的主要病因；而在发展中国家，乙肝病毒（HBV）是肝癌的主要病因，黄曲霉毒素、饮水污染等也起重要作用［1］。暴露于相同环境下的人群仅部分患肝癌，这表明遗传、免疫等内源性因素不同的个体患肝癌的几率不同。沈福民在1991年报告了对肝癌家系资料的分析结果，认为肝癌是一种具有主基因效应的因子遗传病［2］。
　　
　　肝癌患者多数有慢性炎症病史，当炎症慢性迁延，肝癌发生率明显增加，而用抗炎药物能延长晚期肝癌病人生存期。因此，慢性炎症是肝癌发生和发展的重要因素［3］，然而炎症与肝癌发生发展的分子机制仍然不清楚，国内外关于炎症因子之一肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）基因多态性和原发性肝癌关系的报道较少，并且结论不一致。
　　
　　因此，本研究以我国肝癌高发区之一的广东顺德作为研究现场，采用1∶1配对的病例对照研究方法，探讨TNFα308基因多态性与环境因素在肝癌发生中的作用及交互作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象
　　
　　病例来源于广东顺德区各医院2004～2007年确诊并在该区居住＞10年的顺德籍原发性肝癌存活病人，共81例。对照按照1∶1配对方法收集未患肝癌81人，要求其在顺德居住＞10年，与病例同村、同性别，年龄与病例诊断年龄±3岁，无血缘关系。面访调查对象并填写调查表，取静脉血6～10 mL，-20 ℃低温保存。

　　1.2 问卷调查内容
　　
　　年龄、性别等基本情况；吸烟、饮酒、食物摄入情况等生活习惯；肝病史、肝癌史等健康状况。主要变量的定义：肝病史：曾患脂肪肝、肝硬化、肝吸虫等肝脏疾病其中之一者。吸烟：每天吸烟1支以上，时间超过6个月。饮酒：每周饮酒1次以上，时间超过6个月。

　　1.3 实验室检测

　　1.3.1 血清学检测 用酶联免疫吸附试验(ELISA)(上海科华生物工程股份有限公司试剂盒)检测HBV感染5项指标、丙肝抗体、甲胎蛋白、肝吸虫抗体。

　　1.3.2 TNFα308位点基因型的检测

　　1.3.2.1 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs 、NcoI限制性内切酶、琼脂糖均为大连宝生物工程公司产品。蛋白酶K、EB购自上海生工生物工程公司。
　　
　　1.3.2.2 TNFα的PCR扩增及酶切 高盐沉淀法提取基因组DNA［4］。20 μL PCR 反应体系含有:基因组DNA 2 μL，4 μmol/L 上下游引物各1 μL（上游 5′AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT3′，下游 5′TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG3′），10×Buffer 2 μL，25 mmol/L的 MgCl2 1.2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1.6 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/L) 1.25 μL，DMSO(3%)0.6 μL，灭菌双蒸水11.7 μL。扩增条件为94 ℃预变性2 min，然后94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33个循环，最后于72 ℃总延伸5 min。酶切：取PCR产物10 μL，NcoI 1 μL，10×缓冲液2 μL，灭菌水5 μL置37 ℃水浴7 h。
　　
　　1.3.2.3 基因分型 取10 μL酶切产物加缓冲液1 μL，在3%琼脂糖凝胶90 V条件下泳动80 min，于紫外灯下观察TNFα三种基因型。基因型为TNF1/1纯合子时扩增的片段含NcoI酶切位点，可被完全酶切为87 bp、20 bp两条带；TNF1/2杂合子时，产生不完全酶切出现107 bp、87 bp、20 bp三条带；TNF2/2纯合子时，其PCR产物经NcoI消化，不产生酶切，电泳后只出现107 bp一条带。见图1。

　　M：DL200DNA分子量标记物； 1，5：TNF1/1基因型； 2，4：TNF1/2基因型； 3：TNF2/2基因型

　　图1 TNFα308位点基因型电泳结果（略）

　　Figure 1 Electrophoresis plot of TNFα308 genotype

　　1.4 数据统计与分析
　　
　　利用EpiData建立数据库，使用SPSS12.0进行统计分析。

　　1.4.1 计算TNF2等位基因频率，按HardyWeinberg平衡原理确认样本的群体代表性。

　　1.4.2 将单因素分析中有统计学意义的变量引入多因素条件Logistic回归模型，通过向前逐步回归方法，以0.05作为选入变量和以0.10作为剔除变量的显著水平，进行多因素条件Logistic回归分析。求出OR值、OR值95%可信区间及P值。

　　1.4.3 交互作用评价指标
　　
　　指标1 超相对危险比(RERI)=OR（AB）-［OR（B）+OR（APERIOR（AB）=OR（AB）-［OR（B）+OR（AOR（AB）
　　
　　评价因素A，B同时存在时，疾病中可以归因于两因素交互作用的比例。
　　
　　指标3 两因素交互作用指数(SI)=OR（AB）-1［OR（B）-1］+［OR（A）-1］
　　
　　当SI=1时，无交互作用；SI＞1时，为正交互作用；SI＜1，为负交互作用。

　　2 结果

　　2.1 一般情况
　　
　　共调查病例对照81对，采集血样78对，其中男性70对，占89.74%，女性8对，占10.26%。病例组诊断年龄在33～83岁，平均诊断年龄为（57.86±12.06）岁。对照组年龄在30～83岁，平均年龄为（57.65±11.69）岁。

　　2.2 吻合度测验
　　
　　结果显示，对照组TNFα308位点的基因型频率符合HardyWeinberg比例，表明对照组具有良好的代表性(表1)。

　　表1 对照组基因型频率的吻合度检验（略）

　　Table 1 Comparison of genotype frequency distributions of control group

　　χ2=0.54， P＞0.05

　　2.3 原发性肝癌危险因素条件Logistic回归分析

　　2.3.1 原发性肝癌危险因素条件Logistic模型单因素分析 以是否患肝癌为因变量，以吸烟、饮酒、肝病史、HBsAg等26个变量为自变量进行单因素分析，结果显示饮酒、肝病史、HBsAg、抗HBs、抗HBe、抗HBc、TNF2有统计学意义（表2）。

　　表2 原发性肝癌危险因素条件Logistic模型单因素分析结果（略）

　　Table 2 Singlefactor logistic regression analysis for risk factors of PLC

　　2.3.2 原发性肝癌危险因素条件Logistic模型多因素分析 将上述单因素分析中有统计学意义的变量引入多因素条件Logistic回归模型。结果显示（表3）：HBsAg、肝病史、饮酒量、TNF2最终进入模型，与肝癌关联的OR值分别为：7.06（95％CI:2.63～18.94）、5.84（95％CI:1.57～21.77）、2.52（95％CI:1.22～5.23）、2.52（95%CI:1.01～6.48）。

　　表3 原发性肝癌危险因素条件Logistic模型多因素分析结果（略）

　　Table 3 Multivariate logistic analysis for risk factors of PLC

　　2.4 环境因素和TNF2在肝癌发生中的交互作用
　　
　　根据上述分析，选择HBsAg、肝病史、饮酒作为环境危险因素，探讨它们与肿瘤坏死因子基因多态性在肝癌发生中的交互作用（表4）。TNF2等位基因分别与HbsAg、肝病史、饮酒存在交互作用，其OR值分别为19.83(95%CI:4.20～93.61)、7.63(95%CI: 1.05～67.71)、4.57(95 %CI:1.62～12.88)；其RERI分别为14.39、2.22、1.39，表明两者的交互作用所致的发病危险大于其它未知因子导致的发病危险；其API分别为72.53%、29%、30%，表明发生肝癌的危险可归因于两者交互作用的比例较为显著；其SI分别为4.23、 1.50、 1.63，表明两者之间的交互作用为协同作用。

　　表4 环境因素与肿瘤坏死因子基因多态性在肝癌发生中的交互作用（略）

　　Table 4 The interaction between the environmental risk factors and TNFα308 polymorphism in PLC

　　3 讨论
　　
　　TNFα基因大小为2.76 kb，由4个外显子和3个内含子组成，定位于第6对染色体短臂上。TNFα308位点存在G→A的替代，G存在时定义为常见型TNF1，A存在时定义罕见型TNF2［5］。TNF2等位基因能够增强TNFα的转录6～7倍，并在基因转染中能诱导mRNA的表达［6］。有证据表明，TNFα通过正反馈来增加它的分泌［7］。因此，在不同个体携带TNFα308位点基因型的不同，导致TNFα的分泌浓度有差异，仅较小的浓度差异就可能通过自身放大效应影响最终炎性反应的结果。
　　
　　本研究中，肝癌患者携带TNF2等位基因的频率比较高，携带TNF2等位基因无论是纯合子还是杂合子都有更高的患肝癌风险，OR值是2.52(95%CI:1.01～6.48)，TNF2等位基因可能是肝癌的遗传易感基因。这和来自台湾的Ho ShengYow ［8］，OR值3.5(95%CI:2.1～6.0)；JenEing Jeng［9］ OR值3.23(95%CI:1.10～9.44)的研究报道是一致的。
　　
　　本次流行病学调查发现，HBsAg、肝病史、饮酒、携带TNF2等位基因是肝癌的危险因素，并且TNF2等位基因分别与HbsAg、肝病史、饮酒存在协同交互作用，可见肝癌的发生是一个由外源性因素和内源性因素共同参与的、多阶段、多步骤的复杂过程。

　　3.1 HBsAg与TNF2等位基因在肝癌发生中的交互作用
　　
　　临床发现HBV患者的TNFα含量明显高于健康对照组，它的含量与病毒复制活跃有关，并且随炎症程度及纤维化程度加重而升高［10］。其原因可能有：①HBV可作为TNFα的强诱导剂，直接刺激机体产生TNFα［11］。②TNFα增多导致炎症连锁反应启动，促进其他细胞因子持续性释放，加剧肝细胞炎症、坏死和肝纤维化［12］。③TNFα可通过激活NFκB［13］拮抗携带肝炎病毒的肝细胞凋亡并促进它的增殖，从而引起病毒的持续复制和扩散。携带HBsAg并具有TNF2等位基因患者分泌的TNFα较多，可能会增加肝癌发生的危险。

　　3.2 肝病史与TNF2等位基因在肝癌发生中的交互作用

　　3.2．1 脂肪肝与TNF2等位基因在肝癌发生中的交互作用 高脂饮食使肝内的脂肪酸（FFA）增多，它的增加不仅对肝细胞有直接毒性，还可激活枯否细胞生成TNFα［14］，并具有加强TNFα细胞毒性的作用。另一方面，TNFα可诱导肝细胞内甾体调节元件结合蛋白1的表达［15］，促进脂肪酸合成及肝细胞内三酰甘油的积聚。TNFα可调节肝细胞中内毒素介导的解偶联蛋白(UCP2)mRNA的表达，导致脂肪变性的肝细胞敏感性增强而易发生炎症坏死［16］。研究发现，意大利人群中脂肪肝患者的TNF2携带率增加［17］，TNF2可能是脂肪肝发生的一个易感基因。

　　3.2．2 肝硬化与TNF2等位基因在肝癌发生中的交互作用 TNFα是肝纤维化形成的关键细胞因子。TNFα受体缺陷的转基因小鼠前胶原和TNFα合成均显著减少［18］，且几乎没有纤维化的病理组织学改变。TNFα一方面可介导一系列炎症细胞因子的分泌，并通过炎症反应来增加转化生长因子β，刺激细胞外基质(ECM)合成增加；并能上调肝细胞蛋白水解酶抑制物的合成，引起ECM的降解减少。从而导致ECM过度沉积形成肝纤维化。另一方面TNFα可促进肝星状细胞增生并向肌成纤维细胞（MFb）转化［19］，形成肝硬化。肝硬化具有TNF2等位基因的患者通过上述途径增加肝癌的发生风险。
　　
　　林菊生等［20］发现携带TNF2等位基因的个体在乙肝后发生肝硬化比不携带者的危险性增加1.17倍；Tokushige等［21］报道携带TNF2等位基因者在丙肝后发生肝硬化的危险性高5.1倍。国内外研究比较一致地认为TNFα308基因多态性与乙肝、丙肝后肝硬化的遗传易感性相关。Czaja等［22］报道携带TNF2等位基因在I型自身免疫性肝炎患者比正常对照者多见，并更容易进展到肝硬化。这提示TNFα的基因多态性与肝病的易感性及疾病的进程有一定的关系。
　　
　　其他肝病史如肝吸虫病，并携带TNF2等位基因的患者，由于肝吸虫的刺激及其分泌物的毒性作用，可使胆管上皮细胞增生，长期的刺激会使这类患者的炎症反应和胆管上皮异常增生比不携带TNF2等位基因的患者严重，导致癌变的风险增加。

　　3.3 饮酒量与TNF2等位基因在肝癌发生中的交互作用
　　
　　用酒精喂养鼠，肝内枯否细胞分离培养后，可见TNFα相应的mRNA水平升高［23］。而敲除TNFα受体基因的大鼠给予酒精喂养不引起肝脏的炎症和坏死性改变［24］。
　　
　　本研究表明，HBsAg、饮酒量、肝病史、携带TNF2等位基因是广东顺德地区肝癌的危险因素。HBV感染、肝病史、饮酒这些环境因素与TNF2在肝癌的发生中存在一定的交互作用，这种交互作用加重了单一因素对机体的危害。由于无法改变人体自身的基因型，因此，只有控制HBV感染，改变不良生活习惯，选择健康的生活方式，才可能有效地预防肝癌。

参考文献

　　［1］ 顾公望，周汉高.肝癌研究病因的共识［J］.世界肿瘤杂志，2002，1(1)：1-3.

　　［2］ SHEN F M， LEE M K， GONG H M， et al. Complex segregation analysis of primary hepatocellular carcinoma in Chinese families: Interaction of inherited susceptibility and Hepatitis B viral infection［J］. Am J Hum Genet，1991，49:88.

　　［3］ BLOCK T M， MEHTA A S， FIMMEL C J， et al. Molecular viral oncology of hepatocellular carcinoma ［J］. Oncogene， 2003， 22(33):5093-5107.

　　［4］ MILLER S A， DYKES D D， POLESKY H F.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells［J］. Nucleic Acid Res， 1988，16:1215.

　　［5］ WILSON A G， SYMONS J A， MCODOWELL T I， et al. Effects of polymorphism in the human tumor necrosis factorα promoter on transcriptional activation［J］. Proc Natl Acad，1997，94: 3195-3199.

　　［6］ ABRAHAM L J， KROEGER K M. Impact of the308 TNF promoter polymorphism on the transcriptional regulation of the TNF gene: relevance to disease［J］. Leukoc Biol， 1999，66:562–566.

　　［7］ WHEELHOUSE N M， CHART Y S， GILLIES S E， et al．TNFalpha induced DNA damage in primary murine hepatoeytes［J］ .Int J Mol Med，2003，12(6):889-894.

　　［8］ HO Shengyow， WANG Yingjan， CHEN Henli， et al. Increased risk of developing hepatocellular carcinoma associated with carriage of the TNF2 allele of the 308 tumor necrosis factora promoter gene［J］. Cancer Causes and Control， 2004，15: 657-664.

　　［9］ JENG J E， TSAI J F， CHUANG L Y， et al．Tumor necrosis factorα 308.2 polymorphism Is associated with advanced hepatic fibrosis and higher risk for hepatocellular carcinoma［J］. Neoplasia，2007，9(11):987-992.

　　［10］ 苏是苍，李承彬，胡勤明.慢性乙肝肝纤维化不同分期TNFα、NO和内毒素水平变化［J］.标记免疫分析与临床，2006， 13 (3):131-132.

　　［11］ GONZALEZ S， RODRIGO L， MARTINEZ B J， et al. TNFalpha308A promoter polymorphism is associated with enhanced TNFalpha production and inflammatory activity in Crohns patients with fistulizing disease ［J］.Am J Gastroentero，2003，98(5):1101-1106.

　　［12］ KROEGER K M， CARVIUE K S， ABRAHAM L J， et al. The308 tumor necrosis factoralpha promoter polymorphism effects transcription［J］.Mol Immuno，2007， 34(5):391-399.

　　［13］ 杨季云，张思仲，郭红，等.肿瘤坏死因子α通过激活NFκB信号通路加快肝细胞周期进程［J］.生物化学与生物物理进展， 2007，34(6):604-610.

　　［14］ 范建高，徐正捷，王国良，等.高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型［J］.世界华人消化杂志，2002，10(4):392-396.

　　［15］ ARIEL E， FELDSTEIN， NATHAN W， et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF expression via a lysosomal pathway［J］. Hepatology， 2004，40(1):185-194.

　　［16］ 钱燕， 范建高.TNFα在非酒精性脂肪性肝病中的作用及其机制［J］.国际消化病杂志，2006，26(4):266-269.

　　［17］ VALENTI L， FRACANZANI A，DONGIOVANNI P， et al．Tumor necrosis factor a promoter polymorphisms and insulin presistance in non alcoholic fatty liver disease［J］.Gastroenterology，2002，122(2):274-280.

　　［18］ SIMEONOVA P P，GALLUCCI R M，HULDEMN T，et al．The role of tumor necrosis factoralpha in liver toxicity， inflammation， and fibrosis induced by carbon tetrachloride［J］.Toxicol Appl Pharmacolcol， 2001，177(2):112-120.

　　［19］ 陈伟锋，汪谦，张可飞，等. 肿瘤坏死因子α对肝星状细胞形态及表达结缔组织生长因子的影响［J］. 中华实验外科杂志，2005，22(8):922-925.

　　［20］ 林菊生，程元桥，田德英.HLADRB 1和肿瘤坏死因子α基因多态性与肝硬化的遗传易感性［J］.中华内科杂志，2002，41(12):818-822.

　　［21］ TOKUSHIGE K，TSUCHIYA N，HASEGAWA K，et al. Influence of TNF gene polymorphism and HLA—DRB 1 haplotype in Japanese patients with chronic liver disease caused by HCV［J］．Am J Gastroenterol，2003，98：l60-l66．

　　［22］ CZAJA A J， DONALSON P T. Genetic susceptibilities for immune expression and liver cell injury in autoimmune hepatitis［J］. Immunological Review， 2000， 174: 250-259.

　　［23］ 吴金明，王思元，梁扩寰.大鼠酒精性肝损害时血浆细胞因子TNFα、IL6水平的变化及其意义［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2002，11(2):115-117.

　　［24］ YIN M，WHEELER M D， KONO H， et al.Essential role of tumor necrosis factor α in alcoholinduced liver injury in mice［J］.Gastroentero1ogy，1999，117(4)：942-952.