重组人白介素10对TNFα诱导的血管外膜成纤维细胞syndecan4蛋白表达的影响

　　　　 作者：左琦，欧阳平，张建兴，王峰，贝伟剑，赖文岩，许顶立

【摘要】 　　目的 观察重组人白介素10（IL10）对肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激的血管外膜成纤维细胞（NIH/3T3细胞）增殖和syndecan4蛋白表达的影响。 方法 采用体外培养的NIH/3T3细胞，分别应用终质量浓度为20 ng/mL TNFα、100 ng/mL IL10、200 ng/mL IL10、100 ng/mL IL10联用20 ng/mL TNFα、200 ng/mL IL10联用20 ng/mL TNFα作用24 h，并设对照组进行比较，采用MTS/PMS法确定NIH/3T3细胞的增殖状态，利用Western blot蛋白免疫印迹法测定NIH/3T3细胞中syndecan4蛋白的表达。结果 （1）MTS/PMS法测定各组细胞增殖率统计分析显示：与对照组比较，TNFα组能显著刺激NIH/3T3细胞的增殖（P<0.001），而IL10不同剂量组单独应用对NIH/3T3细胞的增殖均无明显作用（P>0.05）。IL10联合TNFα共同作用组与TNFα组比较，NIH/3T3细胞增殖均显著减少（P<0.01）。（2）Western blot蛋白免疫印迹法测定显示：与对照组比较，TNFα组能显著刺激NIH/3T3细胞中的syndecan4蛋白表达（P<0.05），而IL10不同剂量组单独应用对NIH/3T3细胞的syndecan4蛋白表达均无明显影响（P>0.05）。IL10联合TNFα共同作用组与TNFα组比较，NIH/3T3细胞的syndecan4蛋白表达显著降低（P<0.001）。结论 IL10可明显抑制TNFα诱导的NIH/3T3细胞增殖及细胞syndecan4蛋白的表达。

【关键词】 白介素10 syndecan 4 肿瘤坏死因子α 成纤维细胞 细胞增殖

　　Abstract:Objective To investigate the effect of recombinant human interleukin10（IL10）on proliferation of adventitial fibroblasts and expression of syndecan4 protein induced by tumor necrosis factorα（TNFα）. Methods NIH 3T3 cells were cultured in vitro and exposed to 20 ng/mL TNFα，100 ng/mL IL10，200 ng/mL IL10，100 ng/mL IL10 with 20 ng/mL TNFα，and 200 ng/mL IL10 with 20 ng/mL TNFα respectively. All groups were treated for 24 h in vitro，and were compared with the control group.The ratio of proliferation of NIH/3T3 cells was determined by nonradioactive MTS/PMS assay and the expression of syndecan4 protein was evaluated by Western blotting using antisyndecan4 antibodies. Results Statistical analysis showed that， (1) Compared to the control group，TNFα significantly stimulated the proliferation of NIH/3T3 cells at the concentration of 20 ng/mL in TNFα group (P<0.001). IL10 alone had no effect on NIH/3T3 cells growth (P>0.05)，but significantly inhibited NIH/3T3 cells proliferation induced by TNFα (P<0.01). (2) Compared with the control group，the expression of syndecan4 protein in NIH/3T3 cells was significantly enhanced by TNFα at the concentration of 20 ng/mL(P<0.05). IL10 alone had no effect on the expression of syndecan4 protein(P>0.05)，but significantly inhibited the expression of syndecan4 induced by TNFα(P<0.001).Conclusion IL10 could inhibit expression of syndean4 protein in NIH/3T3 cells induced by TNFα in vitro.

　　Key words:interleukin10; syndecan4; tumor necrosis factorα; fibroblast; cell proliferation

　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种机体对血管损伤产生过度炎症反应所导致的慢性炎症性疾病。目前研究表明［1］，血管外膜炎症与AS的严重程度以及斑块的不稳定性呈正相关性，血管外膜成纤维细胞（adventitial fibroblasts，AF）的增生、向内膜迁移及表型转变是AS发生发展的主要推动因素之一。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factoralpha，TNFα）是炎症反应的关键调节因子之一，可从多种不同的炎症细胞中释放，在AS发生发展中起着关键的作用。Syndecan4是硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。它作为一种与生长因子结合的共受体（coreceptor），调控着多种细胞生物学效应，在细胞的伸展、识别、黏附、迁移和增殖控制中扮演着重要角色，同时也介导炎性反应［2］。白细胞介素10（interleukin10，IL10）是近年来研究最为广泛的一种由体内产生的内源性的抗炎因子，在多种炎性疾病中发挥效应，其主要功能是限制和终止炎症反应。本研究观察了IL10对TNFα诱导的血管外膜成纤维细胞增殖及syndecan4蛋白表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料
　　
　　NIH/3T3细胞株，购于ATCC (American Type Culture Collection)。DMEM培养基、0.25%胰酶均购自Gibco公司。胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司。一次性96孔板购自Corning公司。TNFα、IL10均购于Peprotech公司。CellTiter 96 Assay MTSPMS试剂盒购于Promega公司。一抗为兔抗大鼠syndecan4多克隆抗体H140，购置于Santa Cruz公司（sc15350）。二抗为羊抗兔IgG抗体，购置于Amersham公司（NA934）。ECL化学发光试剂盒购于Pierce公司。其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 NIH/3T3细胞于含10%(φ)胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，当细胞生长达亚融合状态时收获细胞供实验所用。

　　1.2.2 细胞增殖评价 体外培养的NIH/3T3细胞在96孔板中以5 000个细胞/孔的密度铺板。8 h后，换成无血清含谷氨酸的DMEM培养基，维持48 h以获得同步的细胞生长停止，随后将已配制好的试剂：20 ng/mL TNFα、100 ng/mL IL10、200 ng/mL IL10、20 ng/mL TNFα+100 ng/mL IL10、20 ng/mL TNFα+200 ng/mL IL10分别加入。对照组为含5%FBS的DMEM培养基。24 h后细胞的增殖率通过应用96 Assay MTS/PMS试剂盒确定。用BioRad 550型Microplate Reader以490 nm波长测量吸光度（A）值，细胞的增殖率用A值表示。

　　1.2.3 Syndecan4蛋白免疫印迹测定 将体外培养的NIH/3T3细胞分别用已配制好的试剂：20 ng/mL TNFα、100 ng/mL IL10、200 ng/mL IL10、20 ng/mL TNFα+100 ng/mL IL10、20 ng/mL TNFα+200 ng/mL IL10刺激，对照组为10％FBS DMEM培养液。24 h后用DHanks液冲洗，冰上裂解细胞，收获蛋白。取适量待检测蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， 将已分离的条带电转移到PVDF膜上， 4 ℃封闭过夜，加入配置好的一抗（1∶200稀释）、二抗（1∶10 000稀释）孵育，用ECL化学发光试剂盒检测。βactin检测作为内对照。实验胶片用光密度扫描仪扫描，结果用图像软件BIORAD Quantity One分析。

　　1.2.4 统计学分析 所有数据均以（±s）表示，应用SPSS13.0软件包，采用 ANOVA分析，组间比较方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用GamesHowell检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 IL10对TNFα诱导的NIH/3T3细胞增殖的影响
　　
　　各组细胞的增殖率分别为:对照组0.577±0.052，TNFα 20 ng/mL组0.634±0.040，IL10 100 ng/mL组0.587±0.035，IL10 200 ng/mL组0.575±0.052，TNFα 20 ng/mL 联用 IL10 100 ng/mL组0.571±0.061，TNFα 20 ng/mL 联用 IL10 200 ng/mL组0.575±0.068。统计分析结果表明，与对照组比较，20 ng/mL TNFα组能显著刺激NIH/3T3细胞的增殖（P<0.001），而100 ng/mL IL10、200 ng/mL IL10组单独应用对NIH/3T3细胞的增殖均无明显影响（P>0.05）。100 ng/mL IL10+20 ng/mL TNFα、200 ng/mL IL10+20 ng/mL TNFα组与20 ng/mL TNFα组比较对NIH/3T3细胞增殖有显著的抑制作用（P<0.01），但未显示剂量依赖性（见图1）。实验所用细胞的台盼蓝染色证实细胞处于存活状态。

　　A.Control; B.TNFα 20 ng/mL; C.IL10 100 ng/mL; D.IL10 200 ng/mL; E.TNFα+IL10 100 ng/mL; F.TNFα+IL10 200 ng/mL

　　与A组比较:*P<0.001；与D组比较:#P<0.01

　　图1 IL10对TNFα诱导的NIH/3T3细胞增殖的影响（略）

　　Figure 1 Effects of rhIL10 on the proliferation of NIH/3T3 cells induced by TNFα

　　2.2 IL10对TNFα诱导的NIH/3T3细胞syndecan4蛋白表达的影响

　　
　　以目的蛋白对照组灰度值与内参（βactin）对照组灰度值的比值为1，其余各组syndecan4蛋白相对表达量分别为：TNFα 20 ng/mL组2.103±0.220， IL10 100 ng/mL组1.146±0.054， IL10 200 ng/mL组1.235±0.215， TNFα 20 ng/mL+IL10 100 ng/mL组0.996±0.072， TNFα 20 ng/mL+IL10 200 ng/mL组1.082±0.136（如图2）。统计分析表明，与对照组比较，TNFα组能显著刺激NIH/3T3细胞的syndecan4蛋白表达（P<0.05），而IL10不同剂量组单独应用对NIH/3T3细胞的syndecan4蛋白表达均无明显影响（P>0.05）。TNFα联合IL10共同作用组与TNFα组比较对NIH/3T3细胞的syndecan4蛋白表达均有显著抑制作用（P<0.001）。重复3次得到相同的结果。

　　Lane 1:Control;Lane 2:TNFα 20 ng/mL;Lane 3:IL10 100 ng/mL;Lane 4:IL10 200 ng/mL;Lane 5:IL10 100 ng/mL+TNFα 20 ng/mL;Lane 6:IL10 200 ng/mL+TNFα 20 ng/mL

　　图2 IL10对TNFα诱导的NIH/3T3细胞 syndecan4蛋白表达的影响（略）

　　Figure 2 Effects of IL10 on expression of syndecan4 protein in NIH/3T3 cells induced by TNFα

　　3 讨论
　　
　　血管外膜的炎症是AS病变的积极参与者，成纤维细胞是血管外膜的主要细胞成分。血管损伤后，局部血管缺血、缺氧，成纤维细胞能够快速适应局部血管的需要，由“静止”状态转为“激活”状态，启动Gq蛋白信号转导通路，激活蛋白激酶C和促分裂原活化蛋白激酶家族成员，迁移至内膜下区域和新生内膜中并增殖，并分泌多种活性因子包括内皮素、骨桥蛋白、肝细胞生长因子及结缔组织生长因子等，诱导细胞的增殖分化。因此，外膜成纤维细胞的增殖在血管阻塞性疾病的发生发展中扮演着重要的角色。
　　
　　目前研究表明，syndecan4在炎症及组织创伤愈合中发挥着重要的作用［3］。其表达在动脉损伤早期即可增加，随后在7 d内减少到可控制的水平。Telci等研究显示，在组织损伤修复中，syndecan4可与纤维结合蛋白转谷氨酰胺酶复合物结合，激活蛋白激酶Cα后，syndecan4聚集并与β1整合素结合，激活细胞存活机制及RGD依赖的细胞黏附，从而导致MAPK途径激活及肌动蛋白应力纤维形成［4］。Syndecan4与血管外膜成纤维细胞在共同参与AS病变过程发生发展有着密切的联系。Li等研究发现，动脉壁损伤后，血管外膜成纤维细胞受到血管壁机械牵张刺激会引起syndecan4的表达明显增高，并伴随有syndecan4蛋白脱落的增强和局部黏附的分解，而通过syndecan4的调节作用，促进了血管外膜成纤维细胞从血管外膜迁移到血管新生内膜的激活过程。研究进一步发现，syndecan4的表达在动脉壁受损后的2 h到3 d内在血管外膜最先出现，5 d左右在血管中层检测到，14 d左右在血管新生内膜表达，与以往Julien等研究提出的血管外膜成纤维细胞透壁性迁移的观点相符［5，6］。Kuriyama［7］等研究发现，syndecan4参与了神经诱导作用中的FGF/MAPK和PKC/ROC/AP1两个重要信号传导通路。syndecan4作为一种重要的跨膜蛋白，是信号从细胞表面传导到细胞内部的重要传递者，也是细胞外信号引起细胞增殖反应的重要递呈者。位于细胞表面的syndecan4主要通过激活蛋白激酶Cα参与细胞的信号传导。在细胞因子等致AS因素的刺激下，syndecan4通过硫酸乙酰肝素链与胞外的配体相结合，并调节其活性，经保守的跨膜区传导进入胞内，在其胞质尾区发生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使syndecan4与PIP2的亲和力增强，从而激活了蛋白激酶Cα，进一步激活了ERK1/2(p44/42 MAPK)，从而启动了大多数促细胞增殖的共同途径ERK途径。
　　
　　T细胞（包括Th1细胞、Th3细胞、NK T细胞）介导的免疫调节反应在AS的病变发生发展中扮演着重要的角色［8］。近年来研究发现，IL10是调节性T细胞发挥免疫调节功能以控制AS病变进展所需要的主要细胞因子之一。Th1细胞分泌的致炎因子(如TNFα等)与Th3细胞分泌的抗炎因子(如IL10等)比例失衡在AS发病机制中起着重要的作用。TNFα是炎症反应的关键调节因子之一，主要由巨噬细胞产生，与正常的细胞相比，在AS病变中其表达上调。IL10的主要功能是限制和最终终止炎症反应。IL10对IL1和TNF的抑制效应是其抗炎活性的关键所在。Giachini FR等研究发现，IL10可通过作用于ERK1/2信号通路明显降低血管对TNFα诱导的内皮素1的反应［9］。Brennan FM研究小组发现，IL10可通过调节TNFα转换酶（TNFalphaconverting enzyme，TACE）的活性来调节TNFα的作用［10］。Ambrosius等研究发现患者血清IL10浓度越低，超声探查其颈动脉内膜、中膜的平均厚度越厚［11］。IL10还可以通过抑制由各种刺激因子引起的核因子κB（NFκB）的活化，从而使各种促炎细胞因子（IL1、IL6和TNF等）的产生减少［12］。根据目前实验结果，推测TNFα可能通过与成纤维细胞表面的相应TNF受体结合，刺激syndecan4蛋白的表达增加，随后激活了蛋白激酶Cα，最终激活p44/42 MAPK信号传导通路，导致细胞增殖。而IL10可能通过抑制TNFα诱导的syndecan4蛋白的表达，从而抑制了蛋白激酶Cα的激活，最终抑制了p44/42 MAPK的磷酸化，最终导致细胞增殖的减少。
　　
　　综上所述，本研究表明一定剂量的IL10能够显著抑制TNFα诱导的NIH/3T3细胞增殖和syndecan4蛋白表达。因此，有必要进一步研究IL10抑制syndecan4蛋白表达的相关潜在靶点。

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