Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白研究进展

【关键词】 Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白 转录因子 真菌

　　锌指(zinc fingers)是指含有Zn2+的可与DNA相互作用的蛋白质基序(motif)，含有锌指基序的转录因子是一个大家族。目前已发现10多种不同种类的锌指基序，Zn(Ⅱ)2Cys6型锌指基序就是其中的一种，其组成是CysX2CysX6CysX5-12CysX2CysX6-8Cys，此基序中的半胱氨酸与2个锌离子结合。含有此基序的转录因子被称为Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白，仅存在于真菌中。1982年分离出的第一个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白是Gal4p［1，2］，Gal4p是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）半乳糖代谢相关基因的转录调节因子，在半乳糖存在下可以激活半乳糖代谢相关基因的转录。
　　
　　Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可参与调节真菌的基础代谢、次级代谢、药物抗性及减数分裂等过程，其中对真菌次级代谢中相关的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的研究将有助于了解真菌的次级代谢的调控过程。

　　1 Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的结构及其作用方式
　　
　　对已知的多种真菌的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的结构分析表明，从蛋白质的氨基端到羧基端分别由DNA结合域（DBD，DNAbinding domain）、调控域(regulatory domain)和酸性域(acidic region)组成。其中DBD又可分为锌指结构域(Zinc finger domain)、连接区域(linker region)以及二聚化区域(dimerization region)，在二聚化区域常含有螺旋的螺旋结构（Coiledcoil）。Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可以单体、同源二聚体或异源二聚体的方式与DNA相互作用。个别锌簇蛋白的DBD结构域位于羧基端［3］。有时Zn2+可被其它金属离子所替代，如Cd2+可取代Gal4p中的Zn2+［4］。调控域与锌簇蛋白对靶基因的转录激活功能有关，如果缺失该区域，可能造成靶基因的表达被持续激活，即该区域可能是起到抑制转录激活的作用。羧基端的酸性域是转录激活域。
　　
　　Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白结合于目标基因的启动子区的DNA序列，所结合的DNA元件的保守序列是单个或重复的三核苷酸序列CGG［5］，结合的特异性与CGG三联体的方向、三联体之间的距离及CGG周围的碱基序列有关，常见的结合序列是CGGN6CCG 或CGGN11CCG。如转录因子Leu3p(参与亮氨酸代谢的调节)和Ppr1p（参与嘧啶代谢的调节）所辨认结合的2个CGG的间距分别为4 bp和6 bp［6］，按照CGG三联体的排列方向，这些DNA序列可被分为反向重复（inverted repeat）、翻转重复(everted repeat)和正向重复(direct repeat)3种类型，如图1所示（其中Hap1参与细胞色素C表达的调节）。二聚体Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白与DNA序列相互作用的方式如图2所示。Gal4p识别位点: CGGAAGACTCTCCTCCG Ppr1p识别位点: TCTTCGGCAATTGCCGAAGA

　　反向重复 GCCTTCTGAGAGGAGGC 反向重复 AGAAGCCGTTAACGGCTTCT

　　Leu3P识别位点： TGCCGGTACCGGCTTGG Hap1识别位点：GCCGGGGTTTACGGACGATGA

　　翻转重复 ACGGCCATGGCCGAACC 正向重复 CGGCCCCAAATGCCTGCTACT

　　图1 部分锌簇蛋白识别的DNA序列，图框中是CGG三联体［6］（略）

　　Figure 1 Zinc cluster proteins preferentially recognize CGG triplets

　　图2 锌簇蛋白与DNA序列的结合方式［5，6］（略）

　　Figure 2 Model for DNA binding of Zinc cluster proteins

　　矩形代表二聚体相互作用区域，箭头部分代表与DNA相互作用的区域，指明CGG的方向，矩形与箭头之间是连接区。

　　2 酿酒酵母中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　酿酒酵母的全基因组测序表明其含有54个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白。通过对其中33个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白功能的分析发现，它们多参与氨基酸代谢、多药耐药性、减数分裂等过程的调节。

　　2.1 与多药耐药性相关的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　酵母中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白主要通过激活与多药耐药性（PDR，pleiotropic drug resistance）相关的ABC转运蛋白（ATPbinding cassette transporter protein）的表达而使酵母产生抗药性。这些Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白现已发现十几种［7］，可结合于多药耐药性相关基因（PDR基因）的多药耐药性反应元件（PDREs），这些多药耐药性相关基因已发现有近十种，在这些基因的启动子中常有1到几个PDREs，标准序列为TCCGCGGA。多种Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可以结合于同一基因的PDREs，同一个锌簇蛋白因子往往也可以调节多个PDR基因，这些Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇转录因子可以单独或协同调节PDR基因的转录起始过程，多以同源或异源二聚体的方式作用。这些调节作用多数是正调节作用，促进PDR基因的表达，也有一些起到负调节作用，调节方式及锌簇蛋白的相互作用的关系复杂多样。如Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Pdr1p、Pdr3p和Yrr1p都可激活ABC转运蛋白家族的PDR1基因的表达，它们辨认结合的PDREs序列互有重叠。Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Rdr1p是PDR基因的负性调控因子，△rdr1突变体可抗放线菌酮［8］，而其所结合的PDREs也正是Pdr1p/Pdr3p等的结合位点。ABC转运蛋白家族的PDR12可以在弱酸环境下从细胞中泵出安息香酸和山梨酸，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白War1p可诱导PDR12的表达［9］，在山梨酸胁迫下，War1p可迅速磷酸化并形成同源二聚体，结合于PDR12的启动子区域的酸性反应元件WARE，War1p的磷酸化与PDR12的转录激活几乎是同时发生的。
　　
　　酵母还可以通过调节其麦角固醇的生物合成途径来产生抗药性。麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成成分，当其合成被激活时有利于使酵母产生抗药性，目前认为PDR途径、麦角固醇途径和鞘脂的合成途径等均有相互联系，共同促成酵母细胞的抗药性，麦角固醇和鞘脂及细胞质膜中的其它脂类可形成脂筏（lipid rafts），帮助从细胞中排出药物［10］。至少有11种ERG（ergosterol）基因编码麦角固醇合成相关酶类，它们都含有甾体反应元件。Upc2p和Ecm22p是2个高度同源的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白，有45%的氨基酸相同，有高度相似的DBD及羧基末端的激活域。在细胞中麦角固醇含量低时，它们可通过结合于相同的调控元件来激活ERG2和ERG3基因的转录。△upc2和△ecm22的突变体则不会出现以上的激活作用，使酵母在一些环境中无法存活，如△upc2对抗真菌的吡咯类药物酮康唑敏感，△ecm22对放线菌酮敏感［11］。

　　2.2 酵母中与氨基酸代谢及减数分裂相关的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　酵母中有多个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白参与氨基酸代谢的调节。如ARO9基因编码芳香族氨基酸的转氨酶，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Aro80p通过调控ARO9基因来参与调控芳香族氨基酸的分解代谢，当氨充足时，此基因表达被抑制，当芳香族氨基酸充足时，表达被激活，Aro80p结合于ARO9基因上游-168 bp至-133 bp处的序列，这段序列长32 bp，含有5组CGG三联体序列，从而激活ARO9基因的表达［12］。
　　
　　二倍体的酵母细胞在葡萄糖及氮缺乏时进行减数分裂，形成孢子。在这个过程中，UME6基因可诱导早期减数分裂相关的多个基因的表达。这些基因启动子区都含有URS1序列［13］，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Ume6可结合于相关基因前方的URS1区域。当此因子缺失时，可显著减少对减数分裂相关基因的诱导，使减数分离过程出现缺陷。

　　3 参与真菌次级代谢调节的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白

　　3.1 紫色红曲霉桔霉素合成调节中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　紫色红曲（Monascus purpureus）中产生的桔霉素（Citrinin）对哺乳动物有肾毒性并有致畸倾向，桔霉素的合成酶是PKSCT，其相关基因簇区域为21 kb。在该基因簇5’端上游3.9 kb处有一个总长度为2 006 bp的开放阅读框架，编码有576个氨基酸的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白ctnA。
　　其保守的Zn(Ⅱ)2Cys6基序位于肽链的氨基端。CtnA可促进桔霉素的合成，如果破坏ctnA则导致pksCT的转录水平的大幅度降低。不过，并没有在pksCT的启动子区域发现任何已知的可与锌簇蛋白结合的保守DNA序列。所以ctnA可能是结合了其它的DNA序列，还有待研究［14］。
　　
　　紫色红曲中可合成红曲色素，用于食品的着色；并可产生洛伐他汀，洛伐他汀是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的抑制剂，目前用于临床治疗高血脂症等心血管系统疾病。但是紫色红曲往往同时合成桔霉素，通过对桔霉素合成及调节的研究将有助于抑制紫色红曲中桔霉素的产生。

　　3.2 桔青霉ML236B合成调节中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　桔青霉（Penicillium citrinum）中产生的ML236B(Compactin，康百汀)与洛伐他汀结构相似，可抑制胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶，用作合成普伐他汀（治疗高脂血症的药物）的中间体。康百汀生物合成的相关基因有9个，形成38 kb的基因簇区域。这些基因编码的蛋白质与洛伐他汀生物合成中的酶类也相似。在该基因簇外的mlcR基因编码50.2 kWr的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白，可以促进该基因簇中多数基因的表达［15］。

　　3.3 黄曲霉毒素和柄曲霉素合成调节中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　黄曲霉毒素（Aflatoxin）是一些曲霉菌的重要次级代谢产物，是肝癌发生的危险因子。在寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）以及黄色曲霉（Aspergillus flavus）的基因组中，黄曲霉毒素合成酶基因占据60 kb的区域。黄曲霉毒素的合成被Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白AflR所促进，AflR可结合于黄曲霉素合成基因簇中的多个基因的上游区域。AflR也可结合于其自身基因启动子区，即有自我激活的功能［16］， AlfR对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中的有致瘤倾向的次级代谢产物柄曲霉素（Sterigmatocystin）的合成也有促进作用，在构巢曲霉中，AlfR可结合于柄曲霉素合成相关基因启动子区的TCGN5CGA序列，促进柄曲霉素合成相关基因的表达及柄曲霉素的产生，进一步的研究表明，构巢曲霉中的AflR还与G蛋白偶联受体信号转导途径相关联，当PKA（蛋白激酶A）激活时，可催化AflR磷酸化，磷酸化的AflR将失去其对柄曲霉素合成的促进作用［17］。

　　3.4 串珠镰刀菌串珠镰孢菌素合成调节中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）侵染谷物后产生串珠镰孢菌素（Fumonisins），串珠镰孢菌素与鞘氨醇的结构相似，可干扰正常神经鞘脂的合成。食入被串珠镰刀霉污染的谷物可能导致人和动物发生肿瘤及神经管缺陷。
　　
　　串珠镰孢菌素合成酶基因簇FUM包括16个基因，占据42.5 kb区域。调控该毒素合成的基因不在其合成酶基因簇内部。已发现有5个基因与串珠镰孢菌素合成的调节有关，其中UM21基因在串珠镰孢菌素合成酶基因簇中的FUM1基因的上游663 bp处，有8个内含子，含有两个转录因子的基序。一个是Zn(Ⅱ)2Cys6基序，一个是真菌转录因子保守域。去掉内含子后产生2 016 bp的开放阅读框架，为672个氨基酸编码，产生的蛋白质Fum21p对串珠镰孢菌素的合成有促进作用［18］。

　　3.5 烟曲霉胶霉毒素合成调节中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　烟曲霉（Aspergillus fumigatus）产生的胶霉毒素（Gliotoxin）是一种非核糖体肽类物质，有细胞毒性，可诱发免疫系统中一些细胞的凋亡，引起中毒反应，过敏反应，免疫系统不健全的人群感染它时可发生侵入性的曲霉病(IA，invasive aspergillosis)，严重时会导致死亡。其合成相关的基因簇中包括gliZ，编码一个Zn(Ⅱ)2Cys6转录因子［19］，可激活gli基因簇的表达，促进胶霉毒素的合成。

　　3.6 葫芦科毛盘孢黑色素合成调节中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
　　
　　葫芦科毛盘孢（Colletotrichum lagenarium）是一种植物病源菌，可导致黄瓜炭疽病。侵染过程中产生黑色素(melanin)，在形成附着胞(appressorium)时和菌丝生长时都可产生黑色素。对黑色素合成的调节的研究发现了一个可促进黑色素合成的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Cmr1p［20］，Cmr1p含有984个氨基酸，在其氨基端含有2个Cys2His2锌指基序，分别位于第4～24 bp和第32～53 bp位置，接着是一个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白基序，位于第76～103 bp位置。Cmr1p同时含有Cys2His2锌指基序和Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白基序，这在真核生物的转录因子中属于罕见的情形。

　　4 展望
　　
　　近年来研究发现，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白在多种真菌的一些重要的次级代谢产物的合成中都有调节作用，包括一些真菌毒素合成的调控及有益产物合成的调控。在多种Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的调节机制的研究中已发现，同一个基因可以被多种Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白调节，不同调节因子在目标基因启动子区的结合域可以有重叠；另外有些Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可以进行自我调控；Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可通过与目标基因相关的小分子代谢物结合而被激活、或可通过磷酸化或去磷酸化而受到其它因素的调控；有些Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可以募集含有乙酰基转移酶的复合物（含有去乙酰化酶HDACs的复合物）至目标基因的启动子区来激活（抑制）目标基因的转录。
　　
　　对于Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的结构及与DNA序列的结合机制的进一步研究将有助于理解和推测真菌基因表达调控的机制，推进其功能基因组学的研究。

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