Livin、survivin在乳腺癌中的表达及其与caspase3和临床病理的相关性

　　　　 作者：王亚利，王中卫，王西京，金迎迎

【摘要】 目的 探讨livin、survivin在乳腺肿瘤组织中的表达及其与caspase3和临床病理的相关性。方法 免疫组化SP法检测76例乳腺恶性肿瘤及17例乳腺良性病变石蜡包埋标本的livin、survivin和caspase3的表达，分析livin、survivin表达与caspase3及临床病理学特征的关系。结果 Livin、survivin蛋白在乳腺正常组织、不典型增生、导管内原位癌和浸润性癌病变进展过程中呈递增趋势，而caspase3蛋白呈递减趋势，二者呈明显的负相关(P<0.05);Livin蛋白表达与患者年龄、临床分期和淋巴结转移明显相关(P<0.05)，与肿瘤大小、组织学分级无关(P>0.05);Survivin表达与淋巴结转移和肿瘤大小明显相关(P<0.05)，与年龄、组织学分级、临床分期无关(P>0.05)。结论 乳腺癌中livin、survivin可通过诱发凋亡的效应性蛋白酶caspase3抑制凋亡促使肿瘤增殖。年轻患者乳腺癌发生过程中与livin关系更为密切，survivin蛋白在乳腺癌细胞的转移、侵袭等活动中可起到促进作用。

【关键词】 乳腺癌;livin;survivin;caspase3;临床病理;相关性

　　ABSTRACT: Objective To explore the expression of livin and survivin and its correlation with caspase3 and clinicopathology in breast cancer. Methods We examined paraffinembedded archival specimens from 76 cases of malignant breast tumor and 17 cases of benign breast disease for the expression of livin， survivin and caspase3 with immunohistochemistry. The relationship of livin and survivin expression with caspase3 and clinicopathological characteristics was analyzed. Results The positive rates of livin and survivin protein expression were increased gradually in normal breast tissues， livin and survivin proliferating disease， preinvasive carcinoma and invasive breast carcinoma， while the caspase3 protein expression was significantly decreased. The expression of livin and survivin was negatively correlated with that of caspase3 in the four groups (P<0.05). The expression of livin was related to patients age， clinical stage and lymph node metastasis (P<0.05)， but not to tumor size and histologic grade (P>0.05). The expression of survivin was related to lymph node metastasis and tumor size (P<0.05)， but not to age， histologic grade and clinical stage (P>0.05). Conclusion Livin and survivin may play an important role in accelerated tumor proliferation by inducing caspase3 to inhibit apoptosis in breast carcinoma. Livin may be more correlated with carcinogenesis in young patients while survivin may promote metastasis and invasion in breast carcinoma.

　　KEY WORDS: breast cancer; livin; survivin; caspase3; clinicopathology; correlation

　肿瘤的发生、发展与细胞凋亡基因及抑制细胞凋亡基因相互调控作用密切相关。Caspase家族蛋白酶是细胞凋亡的核心机制，其中caspase3与凋亡关系最密切，参与多种因素诱导的细胞凋亡。Livin是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein， IAPs)家族的新成员，通过抑制caspase3、7、9的活性，阻碍多种途径诱导的细胞凋亡[1]。Survivin亦是IAPs的成员，不但抑制细胞凋亡还参与细胞增殖、分裂与细胞周期的调控，与肿瘤的发生、发展密切相关，在人类多种肿瘤组织中均有表达[2]。我们应用免疫组化方法检测livin、survivin和caspase3在乳腺良恶性组织中的表达情况，探讨三者的关系及其与临床病理学特征之间的关系，对于探讨肿瘤细胞的增殖、侵袭机理及新治疗靶点有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 系我院2002年乳腺恶性肿瘤根治术或改良根治术后常规石蜡包埋标本共76例。按1983年全国乳腺癌专业会议制定的病理分类标准，包括浸润性小叶癌4例，浸润性导管癌22例，单纯癌40例，髓样癌3例，导管内原位癌7例。按《国际组织学分类》标准分级，Ⅰ级17例，Ⅱ级33例，Ⅲ级26例。所有病例手术后均按治疗常规行化疗、放疗及内分泌治疗。对照组为17例乳腺良性病变，其中不典型增生7例，乳腺纤维瘤6例，正常乳腺组织4例。

　　1.2 试剂与方法 Livin(1∶5兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司)，可检测livinα和livinβ。Survivin免疫人多克隆抗体和caspase3鼠抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司。SP900试剂盒购自美国BioLegend公司。采用免疫组化SP法，常规石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，抗原修复后30mL/L h3O2阻断内源性过氧化物酶，一抗4℃冰箱过夜依次加入二抗、三抗室温下孵育各10min，各步骤以PBS漂洗，最后DAB显色。苏木素复染、脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3 结果判定 10×20倍光镜下随机选取8个视野观察肿瘤细胞。Livin、caspase3和survivin表达采用半定量积分法，将染色强度分为3级:无着色1分，浅着色2分，棕黄色3分;按阳性瘤细胞的百分比分4级：阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。每张切片最后的得分为两次评分的乘积(1～9分)。≥3分为阳性，<3分为阴性。

　　1.4 随访 以手术日期起到2007年12月31日止，详细记录患者的生存状况、复发、转移及失访时间。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS 13.0分析软件进行Pearson χ2检验分析livin、survivin与caspase3及临床病理学的相关性，用KaplanMeier进行生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Livin、survivin、caspase3蛋白在乳腺良恶性组织中的表达 Livin、survivin和caspase3免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒状，定位于细胞胞质内(图1)。Livin蛋白在乳腺良性组织、乳腺不典型增生、乳腺导管内原位癌和乳腺浸润性癌4组病例中表达分别为1%，28.5%，57.1%，71.1%;Survivin蛋白表达分别为0，14.3%，42.9%和60.9%;Caspase3蛋白表达分别为80.0%，1.4%，42.9%和33.3%。Livin、survivin蛋白在病变进展过程中呈递增趋势，而caspase3蛋白呈递减趋势。

　　Livin、survivin和caspase3蛋白相关分析发现，二者在乳腺浸润性癌组织中表达呈显著负相关(P<0.01，表1、表2)。

　　2.2 Livin 、survivin表达与乳腺恶性肿瘤临床病理学的相关性 Livin蛋白的表达与患者年龄、临床分期和淋巴结转移明显相关(P<0.05)，年龄小、临床分期高、淋巴结转移者表达越高;与肿瘤大小、组织学分级均无关(P>0.05，表3)。

　　乳腺癌组织中survivin表达与淋巴结转移和肿瘤大小明显相关，随肿瘤体积增大，survivin表达的阳性率明显增高(P<0.01)。淋巴结阳性者，survivin表达显著高于阴性者(P<0.01);Survivin表达与年龄、组织学分级、临床分期无关(P>0.05，表4)。表1 乳腺浸润性癌中livin蛋白表达与caspase3的关系表3 乳腺癌(含原位癌)中livin蛋白表达与临床病理参数的相关性

　　2.3 生存分析 获随访结果68例，随访率为89.5%，5年复发21例，其中livin(+)组复发18例(复发率为36.7%)，livin(-)组复发3例(复发率为15.0 %);两组5年复发相对危险度(recurrence relative risk， RRR)为u=2.9597(P<0.05)，KaplanMeier生存曲线示两组累计无复发，生存期有显著差异;survivin(+)组复发12例(复发率为28.6%)，survivin(-)组复发9例(复发率为33%);两组5年RRR为u=1.6352(P>0.05)，KaplanMeier生存曲线示两组累计无复发，生存期无显著差异(P>0.05)。表4 乳腺癌(含原位癌)中survivin蛋白表达与临床病理参数的相关性

　　3 讨 论

　　乳腺癌的发生、发展是多因素共同作用的过程，细胞增殖和凋亡平衡失调在其中起着较为重要的作用。Caspase3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，全部或部分负责大量底物的蛋白水解，抑制caspase3的活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑[3]。IAPs家族是重要的细胞凋亡调节因子，它能抑制细胞表面死亡受体配体、细胞色素C等引起的细胞凋亡。Livin基因是一种新发现的IAP成员，基因位于人染色体20q13.3，全长4.6kb，包含7个外显子及6个内含子，其基因转录产物有两种mRNA亚型，分别编码298个氨基酸的蛋白质(α)和280个氨基酸的蛋白质(β)[4]。Livin与caspases蛋白家族中的多个成员相互作用，尤其是caspases3、7、9的活性，阻止caspase蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡 [5]。目前报道livinα、β及蛋白主要表达于细胞质，只在黑色素瘤、结肠癌、前列腺腺癌和膀胱癌等少数肿瘤细胞中及在胎盘、胚胎组织中表达，在多数正常成人组织中不表达[6]。Survivin 亦是IAP家族成员之一，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，位于染色体17q25，全长15kb。Survivin抗细胞凋亡作用的机制可能是通过其杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列分子中的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84与caspase3、7结合抑制caspase的活性，从而抑制细胞的凋亡。Survivin基因的过度表达抑制了细胞凋亡，有利于细胞的异常增殖和恶性转化。Survivin特异性地表达于胚胎发育组织及分化未成熟组织，并在几乎所有恶性肿瘤组织中出现高表达[78]。

　　本实验结果表明，livin、survivin蛋白在正常乳腺组织→乳腺增生性病变→乳腺原位癌和乳腺浸润性癌4组病例中表达阳性率呈递增趋势，而caspase3蛋白表达呈递减趋势，验证了乳腺癌发生过程中多步骤、渐进性的特点，三者在乳腺癌发生、发展中的起着重要作用。Livin、survivin 与caspase3在乳腺癌中表达呈明显负相关，提示livin、survivin通过诱发凋亡的效应性蛋白酶caspase3而起直接抑制作用。

　　在caspase3蛋白表达呈阴性的42例乳腺癌中有35例livin呈阳性表达，32例survivin呈阳性表达;Survivin蛋白表达呈阴性的27例乳腺癌中，17例caspase3阳性表达，livin蛋白表达呈阴性的20例乳腺癌中，13例caspase3阳性表达，进一步证实livin、survivin基因的抗凋亡作用的机制主要是通过caspase3途径实现的。但另发现livin和caspase3共同阳性表达的乳腺癌有14例，survivin和caspase3共同阳性表达的乳腺癌有10例，暗示livin、survivin基因的抗凋亡作用机制有时是通过非caspase途径实现的，与文献报道一致[9]。

　　进一步研究发现livin表达与乳腺癌患者年龄、临床分期和淋巴结转移有关，livin可成为判断乳腺癌预后不良的标志物，而年轻患者乳腺癌发生与livin关系比较密切。Survivin表达与淋巴结转移和肿瘤大小明显相关，提示survivin在乳腺癌细胞的转移、侵袭等活动中起到促进作用，可作为预后不良的客观指标，对于指导临床治疗和判断预后有一定的意义[10]，与文献报道一致[11]。

　　此外，我们发现livin表达阳性者5年复发率高于阴性者，而survivin表达与5年无复发生存期无关，认为livin、survivin与乳腺癌的预后还需做更多探讨。我们认为livin、survivin和caspase3在乳腺癌发生、发展中起重要作用，不仅参与细胞凋亡的调控，还促进了细胞增殖及肿瘤的发生、发展，可作为抗肿瘤治疗的新靶点。

参考文献

　　[1]CHANG H， SCHIMMER AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatment of malignancy [J]. Mol Cancer Ther， 2007， 6(1):2430.

　　[2]NASSAR A， SEXTON D， COTSONIS G， et al. Survivin expression in breast carcinoma: correlation with apoptosis and prognosis [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2008， 16(3):221226.

　　[3]NOTEBORN MH. Apoptin acts as a tumorspecific killer: potentials for an antitumor therapy [J]. Cell Mol Biol (Noisylegrand)， 2005， 51(1):4960.

　　[4]KASOF GM， GOMES BC. Livin， a novel inhibitor of apoptosis protein family member [J]. J Biol Chem， 2001， 276(5):32383246.

　　[5]WANG R， LIN F， WANG X， et al. Silencing livin gene expression to inhibit proliferation and enhance chemosensitivity in tumor cells [J]. Cancer Gene Ther， 2008， 15(6):402412.

　　[6]LI JH， HE WJ， HE YJ. Expression and clinical significance of Survivin and Livin in DukesoB colorectal cancer [J]. Ai Zheng， 2007， 26(5):547551.

　　[7]ANDERSEN MH， SVANE IM， BECKER JC， et al. The universal character of the tumorassociated antigen surviving [J]. Clin Cancer Res， 2007， 13(20):59915994.

　　[8]KLEINBERG L， FLORENES VA， NESLAND JM， et al.Survivin， a member of the inhibitors of apoptosis family， is downregulated in breast carcinoma effusions [J]. Am J Clin Pathol， 2007， 128(3):389397.

　　[9]CROCI DO， COGNO IS， VITTAR NB， et al. Silencing survivin gene expression promotes apoptosis of human breast cancer cells through a caspaseindependent pathway [J]. J Cell Biochem， 2008， 105(2):381390.

　　[10]YAMASHITA S， MASUDA Y， KURIZAKI T， et al. Survivin expression predicts early recurrence in earlystage breast cancer [J]. Anticancer Res， 2007， 27(4C):28032808.

　　[11]徐虹，蒋东霞，胡杰英，等. 宫颈癌组织中survivin和caspase3蛋白的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版)， 2007， 42(2):263265