Cav1.3 L型钙通道K228E突变体的构建及功能研究

　　作者：强华，孙超峰，魏 峰，张爱峰，史瑞明，马爱群，崔长琮

【摘要】 目的 通过构建Cav1.3基因K228E突变，观察K228E突变对L型钙通道电生理特性及蛋白表达和转运的影响。确定钙通道α1亚基结构域ⅠS4段上N端带正电荷的氨基酸对该通道电生理学特性的作用，从而为创建钙通道起搏器奠定基础。方法 ①一步法快速定点诱变构建Cav1.3基因K228E突变体的真核表达载体;②膜片钳观察突变钙通道电流，激光共聚焦技术观察突变钙通道蛋白在细胞内的表达和定位。结果 ①检测表达于HEK293细胞上的L型钙电流：转染野生型Cav1.3质粒和相关亚基质粒，可检出L型钙电流，其半激活电压V1/2=(-36.56±2.08)mV、半失活电压V1/2 =(-42.93±0.14)mV(5mmol Ba2+);而转染K228ECav1.3质粒和相关亚基质粒的HEK293T细胞上未检测到钙电流;②检测K228E突变通道蛋白在细胞内的表达和定位：转染野生型和突变型Cav1.3质粒及相关亚基质粒，48h后观察到野生型与突变型钙通道蛋白在细胞膜上都有表达。结论 Cav1.3基因K228E突变虽不影响L型钙通道蛋白质的表达与转运，但却不表达钙通道电流，是一种功能丧失性突变。

【关键词】 生物起搏;Cav1.3;L型钙通道;定点诱变;膜片钳

　ABSTRACT: Objective The study is to construct the K228E mutation of Cav1.3 and evaluate its effect on electrophysiological characteristics and protein expression and transport of Ltype calcium channel. The effect of amino acid with positive charges in Nterminal of segment Ⅰ S4 of Cav1.3 on electrophysiological characteristics of Ltype calcium channel is also investigated so as to create a calcium channel pacemaker. Methods ① The eukaryotic expression vector for K228ECav1.3 mutant was constructed by rapid sitedirected mutagenesis; ② Ca2+ current was measured by patchclamp technique; the expression and subcellular localization of Ca2+ channel protein were observed by laser confocal microscopy. Results ① Patchclamp recordings of Ca2+ current: There was obvious current from HEK293T cells transfected with pCDNA6WTCav1.3 and related subunit， V1/2 from steady stateactivation curve was (-36.56±2.08)mV; V1/2 from steady stateinactivation curve was (-42.93±0.14)mV (5mmol/L Ba2+). However， there was no current from HEK293T cells transfected with pCDNA6K228ECav1.3 and related subunit. ② The expression and subcellular localization of Ca2+ channel protein: 48 hours after the HEK293T cells were transfected with WTCav1.3 or K228ECav1.3 plasmids， both the channel protein of WTCav1.3 and K228ECav1.3 were expressed on cell membrane surface. Conclusion The K228E mutation of Cav1.3 channel has no effect on the protein expression and transport of Ltype calcium channel. It is a functional loss mutation which has no expression of Ca2+ current.

　　KEY WORDS: biological pacemaker; Cav1.3; Ltype calcium channel; fixedpoint mutation; patch clamp

　以病态窦房结综合征为主的缓慢型心律失常在临床上并不少见，永久型人工起搏器植入是目前治疗有明显症状的缓慢型心律失常患者最有效的方法，但由于其存在着不少缺点，如起搏器缺乏对神经体液调节的反应性、电池能量的有限性以及感染、血栓等[1]，因此，国内外有学者试图寻找生物起搏的方法，以期达到生理性起搏的目的。生物起搏的核心是选择一种合适的离子通道编码基因作为导入基因。由于用野生型基因构建的生物起搏，其起搏频率适应生理变化的灵活性不足[2]，所以有必要通过分子生物学技术，将野生型离子通道的个别基因进行突变，改变该离子通道的功能，从而构建一个新的起搏基因。Cav1.3 L型钙通道在窦房结细胞起搏中起着重要的作用[3]。如果对该通道的编码基因进行重构，改变其电压激活特性，将其去极化激活改为超极化激活，或将其激活阈值下调(≤-90mV)，有望构建出一个适合起搏的离子通道。本文对钙通道α1亚基结构域ⅠS4段上N端带正电荷的氨基酸对该通道电生理特性的作用进行了探索性研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 携带全长鼠Cav1.3基因(GenBank：AF370009)、Cavβ3基因和Cavα2δ基因的质粒pcDNA6Cav1.3、pcDNA3.1Cavβ3和pcDNA3.1Cavα2δ由美国Brown大学LIPSCOMBE D教授惠赠，质粒pRK5GFP由美国Wisconsin大学ANSON BD博士惠赠。大肠杆菌Top10由我室保存。HEK293T细胞株购自中国典藏培养物保存中心。去内毒素超纯质粒中量提取试剂盒购自美国Omega公司。基因突变试剂盒QuikChangeⅡXL SiteDirected Mutagenesis Kit购自美国Stratagene公司。转染试剂LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司。Cav1.3抗体购自以色列Alomone Labs。其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Cav1.3K228E突变体的构建 我们拟将Cav1.3L型钙通道α1亚基结构域ⅠS4段中第一个带正电荷的碱性氨基酸赖氨酸(K228)诱变为带负电荷的酸性氨基酸谷氨酸(E)。根据QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit的要求，我们设计引物如下(将第682位碱基A→G)：5′GGAGGCT

　　TTGATGTCGAAGCCCTCCGTGCC3′;3′CCTC

　　CGAAACTACAGCTTCGGGAGGCACGG5′。按照试剂盒的说明进行操作。提取质粒后，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆并将突变结果送北京奥科生物技术有限责任公司测序。

　　1.2.2 转染HEK293T细胞 HEK293T细胞在含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中培养。转染前1d，细胞铺板在500μL含血清、不含抗生素的正常生长的DMEM培养基中(24孔板)，使其在转染日密度为50%～60%。转染质粒pcDNA6WTCav1.3(或pcDNA6K228ECav1.3)、pcDNA3.1Cavβ3、pcDNA3.1

　　Cavα2δ和pRK5GFP质粒基因(荧光标记)的比例为3∶3∶3∶1。采用LipofectamineTM 2000脂质体转染法，每孔细胞用18.75μL无血清培养基稀释0.3μg质粒和0.75μL LipofectamineTM 2000，按试剂盒操作步骤进行。转染后放入37℃、50mL/L CO2培养箱，培养48h后进行实验。

　　1.2.3 基因转染HEK293T细胞的通道电流测定 HEK393T细胞在转染后48h，经胰酶消化成单细胞悬液，4h内进行全细胞膜片钳实验。膜片钳放大器为Axon700B单探头膜片钳放大器(美国Axon公司)，数据采集由Clampex9.2完成(美国Axon公司)。玻璃毛细管(北京正天易科贸有限公司)用p97微电极拉制仪(美国SUTTER INSTRUMENT公司)拉制，冲灌电极内液后的电阻阻抗为2～5MΩ。记录钙通道电流时采用的电极外液成分(mmol/L)：Choline Cl 135，MgCl2 1，BaCl2 5，HEPES 10，用CsOH调至pH 7.4;电极内液成分(mmol/L)：CsCl 135，EDTA 1，EGTA 1，MgATP 4，HEPES 10，用CsOH调至pH 7.4。

　　采样参数设置方案(Protocol)：①ICaL电流电压(Ⅰ-Ⅴ)曲线测定：在电压钳模式下，钳制电压-100mV，指令电压去极化自-80mV 至+60mV，阶跃是10mV，每一个指令电压维持时间是300ms，刺激频率0.5Hz。加用P/4漏减。以各刺激电位下电流峰值相对值与相对应电位作Ⅰ-Ⅴ曲线图。②ICaL激活曲线测定：采用上述同样方法，将指令电压改为去极化自-80mV至-10mV，记录到ICaL激活电流，以电流相对值对条件刺激电压作ICaL激活曲线图并按Boltzmann方程进行拟合，求得半激活电压。③ICaL稳态失活曲线的测定：设定钳制电压为-80mV，施于1000ms、阶跃为+10mV、去极化自-80至+10mV的系列条件脉冲刺激，在每一条件脉冲后紧跟一固定除极至0mV、150ms的测试脉冲，记录ICaL，之后电位降至-80mV。以电流相对值对各条件刺激电压作ICaL失活曲线图，并经Boltzmann方程进行拟合，求得半失活电压。

　　1.2.4 细胞免疫荧光检测Cav1.3 L型钙通道蛋白的表达 24孔板中放入预先经明胶处理过的盖玻片，将对数生长期的HEK293T细胞铺于板上，继续生长12h。将pcDNA6WTCav1.3(或pcDNA6K228ECav1.3)、

　　pcDNA3.1Cavβ3和pcDNA3.1Cavα2δ按照1∶1∶1的比例进行转染，48h后吸弃培养液，40g/L多聚甲醛固定15min，PBS洗3遍后，3mL/L的Triton X100室温下打孔15min，山羊血清封闭30min;一抗Cav1.3抗体(1∶25)孵育，4℃过夜;PBS洗3遍;避光37℃下FITC标记的二抗孵育4h，PBS洗3遍，在激光共聚焦显微镜下观察。

　　2 结 果

　　2.1 K228E突变产物的鉴定

　　2.1.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定 挑取克隆，提取质粒，突变型与野生型的pcDNA6Cav1.3模板都是超螺旋结构，电泳图可见一团DNA带，而不是一条线性DNA带，其电泳速度也较相应线性的DNA marker快，最前端快接近7.5kb的marker条带，但通过比较可以发现，K228E突变体质粒与野生型的pcDNA6Cav1.3质粒大小相同(图1)。

　　2.1.2 测序鉴定 DNA测序显示pcDNA6Cav1.3基因载体上目的突变点突变成功，而其他序列均无改变(图2)。

　　2.2 检测Cav1.3基因野生型和K228E突变型的电流

　　2.2.1 野生型Cav1.3钙通道电流的记录 24孔培养板里转染pcDNA6WTCav1.3、pcDNA3.1Cavβ3、pcDNA3.1Cavα2δ和pRK5GFP质粒，48h后进行全细胞膜片钳实验。记录钙电流，绘制Ⅰ-Ⅴ曲线和激活曲线及失活曲线(图3、图4;n=10)，激活曲线经Boltzmann方程拟合，其半激活电压V1/2=-36.56±2.08(5mmol/L Ba2+)，与文献报道一致[4];失活曲线亦经Boltzmann方进行拟合，其半失活电压V1/2 =-42.93±0.14(5mmol/L Ba2+)。

　　2.2.2 K228ECav1.3钙通道电流的记录 HEK293T细胞在转染pcDNA6K228ECav1.3、pcDNA3.1Cavβ3、pcDNA3.1Cavα2δ质粒48h后未记录到电流(n=30，图5)。为了进一步确定K228E突变导致Cav1.3钙电流消失与质粒DNA含量之间的关系，我们将24孔培养板里的HEK293T细胞按照不同的质粒DNA量(0.8、1.6、2.7μg)进行转染，结果仍未记录到钙电流。以上实验说明K228E突变可能引起L型钙通道蛋白表达异常，导致Cav1.3 L型钙通道功能丢失。

　　为了排除K228E突变后，Cav1.3 L型钙通道的激活电位发生较大的改变，以至于上述刺激方波不能测出电流，我们重新设定了刺激方式，钳制电压设定为-80mV，指令电压自-80mV至-200mV，阶跃是-10mV，每一个指令电压维持时间是300ms。加用P/4漏减(图6)，可以看出K228E突变后Cav1.3钙通道在-80mV至-200mV之间依然没有电流产生。

　　2.2.3 K228E突变对Cav1.3钙通道蛋白质表达和转运的影响 在图7中可以看到，细胞膜与细胞浆上可见绿色荧光标记。说明野生型和K228E突变型钙通道蛋白不但在细胞浆里表达，而且在细胞膜上也有大量的表达，细胞膜上的绿色荧光强度差别不大。

　　3 讨 论

　　钙通道是由α1亚基和α2/δ，β，γ等辅助亚基构成的复合体，α1亚基是决定通道电压和药物敏感性的主要亚基，含有四个同源结构域(Ⅰ～Ⅳ)，其中结构域Ⅰ在决定钙通道激活的动力学中起着重要的作用[5]。每一个结构域又由6个片断(S1～S6)组成，其中带正电荷的S4段是Na、K、Ca通道的电压敏感区[6]。STUHEMR[7]发现钠通道的S4段N端带正电荷的氨基酸突变为中性氨基酸时，通道的激活阈值向负性改变。所以本实验的目的是探讨Cav1.3 L型钙通道S4段N端带正电荷的氨基酸对离子通道功能的影响，为今后的生物起搏研究提供一定的理论与实验基础。

　　本研究通过一步法基因诱变技术，将Cav1.3 L型钙通道结构域Ⅰ S4段中第一个带正电荷的碱性氨基酸赖氨酸(K228)诱变为带负电荷的酸性氨基酸谷氨酸(E)，从而成功构建Cav1.3 L型钙通道的突变体(K228E)。然后以真核表达系统HEK293T细胞为表达工具，观察Cav1.3基因K228 E突变的生理功能。研究发现K228E突变可导致Cav1.3 L型钙通道功能丧失，在钳制电位自-80至+60mV之间通道不产生电流。CHEN[8]发现HCN2通道中S4段上K303Q突变后激活电位明显的负向转移(至少-40mV)，以至于没有测出电流。那么Cav1.3基因K228E突变是否也能因为激活电位的大幅度改变而没有记录到电流?我们用超极化检测方式，结果也没有发现电流(图6)，也就是说钳制电位在-200mV至+60mV不会引起Cav1.3K228E钙通道产生钙电流。

　　图7 激光共聚焦显微镜观察野生型Cav1.3L型钙通道(A)与K228E突变型Cav1.3L型钙通道(B)(×40)

　　Fig.7 Confocal immunostaining of WTCav1.3 Ltype channel (A) and K228ECav1.3 Ltype channel (B) in transfected HEK293T (×40) 常见的基因突变对离子通道的影响包括以下几种：①突变可以只改变通道的某些电生理特征，不改变通道蛋白的表达和转运。②突变影响了该通道蛋白质的表达和/或转运，从而使通道的功能丧失或明显减弱。③突变不影响通道的蛋白质表达和/或转运，但使通道的功能丧失。那么K228E突变导致Cav1.3钙通道功能丧失的机制是否与蛋白质的表达与转运有关?通过细胞免疫荧光技术发现，K228ECav1.3突变体蛋白在细胞膜上的表达与野生型Cav1.3蛋白的表达类似，与QU[9]的报道也相似，说明K228E突变对Cav1.3钙通道蛋白表达和转运的影响不大，其可能存在的影响不应该导致通道功能的丧失。也就说明K228E突变对钙通道功能的影响与蛋白的表达与转运关系可能不大。但是，K228E突变对钙通道蛋白表达的精确影响还需要进一步的实验来说明。

　　SCHLEIFER[10]等研究发现电压敏感性钙通道第Ⅱ结构域S4段的第528位精氨酸突变为组氨酸(R528H)后，不但降低了相关氨基酸残基的移动性，而且使整个钙通道所有带正电荷氨基酸的构象发生改变，从而导致通道电生理特性的改变。CHEN[8]报道HCN2通道中S4段上R315E或R318E突变使通道功能丧失，其机制可能是突变影响了通道的开放;或者也可能R315或R318与S2和S3段上某些氨基酸形成了对通道的稳定性起着重要作用的盐桥，如果将R315或R318突变为E，则可能破坏盐桥的形成和通道的稳定性，使通道的功能丧失。此外，GARCFA[11]等对嵌入型钙通道SKC15的S4段带正电荷的氨基酸突变为中性电荷的氨基酸(Q)时，发现R653Q突变后SKC15产生的电流非常小，而与R656Q同时突变后，电流又恢复，并且提示R653Q突变导致的通道结构改变并可由R656Q突变进行补偿。本实验研究表明：Cav1.3 L型钙通道α1亚基中，结构域ⅠS4段上K228E突变不影响Cav1.3L型钙通道蛋白质的表达与转运，但是却不表达钙通道电流，是一种功能丧失性突变，其导致通道功能丧失的机制可能是突变使Cav1.3钙通道的构象和/或稳定性发生改变，影响通道的门控功能，使通道功能丧失。我们推测K228E突变也可能通过上述原因导致Cav1.3钙通道的构象和/或稳定性发生改变，影响通道的门控功能，导致通道功能丧失，但该推测需要进一步的实验来证实。K228E突变导致L型钙通道功能丧失能否通过联合其他基因突变来抵消?这也需要进一步的实验来证实。

　　本实验为探索性研究，为进一步进行基因突变构建具有起搏功能的钙通道奠定了一定的理论及实验基础。

参考文献

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