作者：王健生，吴文安，张佳，王嗣岑，张明鑫，徐怡庄，石景森，吴瑾光
【摘要】 目的 研究胃癌及癌旁正常组织细胞膜中蛋白质及脂质的傅立叶变换红外光谱(FTIR)的光谱变化及与相应组织、细胞层次光谱变化的差异。方法 提取肿瘤组织和癌旁正常组织的细胞膜，将细胞膜进行溴化钾压片，应用Nicolet Magna750型红外光谱仪对细胞膜的溴化钾压片进行红外光谱检测，获得细胞膜的光谱图，选择其特征性光谱与胃癌组织、胃癌细胞株的相应光谱进行比对。结果 胃癌组织细胞膜的红外光谱特征与相应正常组织细胞膜光谱特征存在异同，且胃癌组织细胞膜与胃癌组织、胃癌细胞株的光谱特征存在异同。主要表现在与脂类相关的2955、2920、2850、1740cm-1谱带的变化。结论 胃癌组织及癌旁正常组织细胞膜上生物大分子红外光谱发生变化及与相应组织、细胞层次红外光谱之间存在差异，其丰富了生物组织红外光谱研究的内容。
【关键词】 胃癌;细胞膜;红外光谱;膜蛋白;膜磷脂
ABSTRACT: Objective To study the protein and lipid in the membrane of gastric cancer tissues and normal tissues with Fourier transform infrared (FTIR) and explore the special spectral features of the membrane of gastric cancer tissues compared with the membrane of normal tissues， cancer cells and cancer tissues. Methods We extracted membrane from cancer tissue and normal tissue samples， sheeted them with KBr， observed them by FTIR and compared the spectral data of the membrane of gastric cancer tissues， the membrane of normal tissues， cancer cells and cancer tissues. Results Both similarities and differences were found in the infrared spectral features between the membranes of gastric cancer tissues and normal tissues. The spectral features of the membrane of gastric cancer tissues had similarities and differences with those of gastric tissues and grastric cell strain， which were shown in the changes of the 2957， 2927， 2853 and 1740cm-1 bands related to lipids. Conclusion The results suggest that the spectral features of the membrane of gastric cancer tissues are significantly different from those of the membrane of normal tissues， cancer cells and cancer tissues， which has enriched studies on biological tissues infrared spectroscopy.
KEY WORDS: gastric cancer; membrane; infrared spectrum; membrane protein; membrane lipid
胃癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在男性恶性肿瘤中仅次于肺癌，在女性居第四位。在全球范围内，胃癌高发国家是日本、俄罗斯、南非等地。在我国，北方的胃癌发病率明显高于南方。据报道，中国每年新发胃癌患者40万人、死亡人数达30万人，而且已呈现年轻化趋势。由于胃癌早期发现困难，预后很差，而早期发现是提高预后的关键。已有学者用傅立叶变换红外光谱(fourier transform infrared， FTIR)技术对胃癌组织和胃黏膜正常组织之间光谱变化进行了研究，发现二者之间有明显的差异，但对于胃癌组织细胞膜和正常组织细胞膜的FTIR研究尚未见报道。本研究应用FTIR技术对胃癌及癌旁正常组织细胞膜中的蛋白质和脂质的变化进行了检测。
1 材料与方法
1.1 标本取材和处理 30例样本均取自西安交通大学医学院第一附属医院2008年2～3月间胃癌患者手术后新鲜标本。手术切除胃标本后生理盐水冲洗净黏液和血污，切取1cm3大小组织2块，一块取自肿瘤中心(非坏死部位)部位，另一块取自离肿瘤切缘最远端。所取组织一分为二，一块放入液氮中冷冻保存备用;另一块100mg/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规病理切片染色检查。
1.2 细胞膜的提取 胃癌及癌旁正常胃黏膜组织细胞膜的制备参照文献[1]方法进行。①取出标本，去除血污及结缔组织，将组织剪碎并于匀浆器中进行匀浆，制成细胞悬液;②细胞悬液1000r/min离心20min，弃上清液，保留沉淀;③用Tris低渗液重悬沉淀，4℃下超声破膜30min;④破膜后于4℃下以1000r/min离心20min，保留上清液;⑤将上清液于4℃下10000g离心20min，弃上清保留沉淀，即为细胞膜;⑥重复上一步骤1次;⑦将细胞膜沉淀真空低温下干燥30min。
1.3 细胞膜纯度的鉴定 用电子显微镜对细胞膜的纯度及膜结构进行鉴定，观察到细胞膜的片状物及由细胞膜卷曲形成的小泡，未发现其他细胞器和细胞成分。
1.4 仪器与方法 采用Nicolet Magna750红外光谱仪。室温条件下，将细胞膜制成溴化钾压片。将溴化钾压片放置于仪器中进行检测，记录红外光谱。扫描次数为128次，扫描范围4000～900cm-1，分辨率4cm-1。光谱用Omnic5.0专用软件分析，逐一测量红外光谱的峰位和峰高。
2 结 果
2.1 病理结果 30例标本经过HE染色病理学检查均为腺癌(图1)。
2.2 红外结果 ①与蛋白有关的谱带：在组织及细胞的红外吸收谱带上，在1800～1500cm-1蛋白质吸收酰胺Ⅰ、Ⅱ谱带范围内，1550cm-1处的酰胺Ⅱ带在癌组织中显得比较弱，峰型低平，而在正常组织中则较强，峰型高尖。相对强度I1650/I1560的比值在癌组织中要比正常组织高(图2)。
②在1500～1300cm-1区间，分别在1453cm-1和1402cm-1附近在组织、细胞及细胞膜的红外光谱中均出现两个吸收峰，两个谱峰的强度在正常、恶性组织的细胞、细胞膜中变化一致，这与前期研究结果相似，都表现为在正常组织中1453cm-1处的峰强于1402cm-1处，而在恶性组织中则相反(图3)。
图3 胃癌及癌旁正常组织细胞膜在1500～1300cm-1区间的FTIR谱图
Fig.3 FTIR spectra of the membrane of cancer and normal tissues from gastric area (1500-1300cm-1)
A: normal; B: cancer
③在3000～2000cm-1区间，在2920cm-1和2850cm-1附近出现的两个波峰在细胞膜的红外光谱图中出现率为100%，且在肿瘤组织细胞膜中的比在癌旁正常组织细胞膜的显得高大(图4)。在1740cm-1附近的吸收峰，在肿瘤组织细胞膜中的比在癌旁正常组织细胞膜的显得高大(图2)，相对强度I1740/I1560的比值肿瘤组织明显高于正常组织。
图4 胃癌及癌旁正常组织细胞膜在3000～2800 cm-1区间的FTIR谱图
Fig.4 FTIR spectra of the membrane of cancer and normal tissues from gastric area (3000-2800cm-1)
A: normal; B: cancer
3 讨 论
作为生命最基本的单位，细胞在恶变过程中除了细胞核、细胞质中蛋白质及脂类等发生变化外，胞膜上的生物大分子如蛋白质、磷脂的结构也发生变化。已有研究表明细胞膜发生的变化对细胞功能的影响意义巨大，其改变了细胞与环境之间的物质流、能量流及信息流[2]。几乎细胞所有的功能都与细胞膜上的蛋白和磷脂有关[3]，所以研究细胞膜上磷脂和蛋白质的变化不仅是对组织、细胞红外的补充，更利于探索膜上大分子结构与功能改变的红外信息。
本研究发现，与蛋白有关的酰胺Ⅰ、Ⅱ谱带变化与课题组前期的研究结果一致[46]。作为与细胞膜磷脂中的甲基和亚甲基的振动[7]有关的2920cm-1和2850cm-1附近的两个谱峰的变化，与在胃癌组织及细胞水平发现的结果存在差异[8]。细胞膜中I1740/I1560的比值与在胃癌组织、细胞等的层面也存在较大差异[910]。
通过比较细胞膜和组织及细胞的红外光谱变化，发现差异主要表现在膜上与蛋白质及磷脂相关的吸收谱带。在1650cm-1和1550cm-1附近，1550cm-1处的酰胺Ⅱ带在癌组织中显得比较弱，峰型低平，而在正常组织中则较强，峰型高尖。相对强度I1650/I1560的比值在癌组织中要比正常组织高，这主要与癌细胞在发生发展过程中细胞膜上的通道、受体及载体改变有关[11]。与脂类有关的吸收谱带则表现为：2920cm-1、2850cm-1和1740cm-1附近的谱带在细胞膜的红外光谱中出现率为100%，且在癌组织细胞膜比在癌旁正常组织细胞膜中波峰显得高大，提示癌组织细胞膜中磷脂含量增加，与安萍[12]、TOYRAN[13]等研究结果一致。本研究发现癌及正常组织细胞膜的红外改变有与组织和细胞水平改变一致的地方，主要表现在1453cm-1和1402cm-1附近的波谱，表现为在癌旁正常组织的细胞膜中1453cm-1处的峰强于1402cm-1处，而在癌组织细胞膜中则相反。这可能与癌细胞与正常细胞中磷脂成分和含量发生改变有关，尚有待进一步研究证实。
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