硫化氢对多器官功能障碍综合征大鼠的保护作用

　　　　作者：刘浩，席孝忠，程永刚，李洁，曹永孝

【摘要】 目的 探讨硫化氢(h3S)对多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠脏器的保护作用。方法 SD大鼠40只，随机分为：①正常对照组;②MODS造模12h组;③MODS造模24h组;④硫氢化钠(NaHS)保护12h组;⑤NaHS保护24h组。试剂盒法检测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)和肌酐(Cr)的含量，观察各组大鼠心、肝、肺、肾、小肠的病理组织学变化。结果 h3S保护组大鼠血清SOD、GSHPx明显增高(P<0.05)，MDA、ALT、CK和Cr的含量明显降低(P<0.05，P<0.01);h3S保护组大鼠心、肝、肺、肾、小肠的器官损伤综合评分较模型组明显改善(P<0.05)。结论 h3S具有明显的抗炎和器官保护作用，对大鼠MODS受损脏器具有保护作用。

【关键词】 硫化氢;硫氢化钠;多器官功能障碍综合征;大鼠

　　ABSTRACT: Objective To investigate the possible protective effects of hydrogen sulfide (h3S) on rats with multiple organ dysfunction syndrome (MODS). Methods NaHS was taken as a donor of h3S. Forty SpragueDawley rats were pided into 5 groups with 8 rats in each group: sham group， MODS 12h model group， MODS 24h model group， NaHS protection 12h and 24h groups. The content of superoxidase dismutase (SOD)， malondialdehyde (MDA)， glutathione peroxidase (GSHPx)， alanime transaminse (ALT)， creatine kinase (CK) and creatinine (Cr) in serum were measured， respectively. The histopathological changes in the heart， liver， lung， kidney and small intestine were observed. Results The serum content of SOD and GSHPx was significantly higher in protected h3S groups (P<0.05)， while MDA， ALT， CK and Cr were significantly lower in protected h3S groups (P<0.05， P<0.01). Organ injury comprehensive scores were significantly higher in MODS groups than in normal groups (P<0.01); organ injury comprehensive scores were significantly lower in protected h3S groups than in MODS groups (P<0.05). Conclusion h3S has obvious protective effects on rats with MODS; thus it can protect the MODSlesioned organs of rats.

　　KEY WORDS: hydrogen sulfide; NaHS; multiple organ dysfunction syndrome (MODS); rat

　多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome， MODS)是临床重症患者死亡的主要原因之一，目前尚缺乏有效的治疗方法。内源性硫化氢(h3S)具有清除氧自由基，抑制炎症反应等作用[1];外源性h3S对肺缺血再灌注损伤、肠缺血再灌注损伤等具有一定的保护作用[23]。但h3S对MODS是否具有保护作用尚不清楚。本研究通过大鼠盲肠造瘘制作多器官功能衰竭模型，探讨h3S对MODS可能的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及试剂

　　1.1.1 实验动物 健康成年SD大鼠40只，雌雄各半，体重(250±10)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2 试剂和药品 硫化氢钠(NaHS)购自美国Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase， SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde， MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase， GSHPx)试剂盒、血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase， ALT)试剂盒、肌酸激酶(creatin kinase， CK)试剂盒和肌酐(creatinine， Cr)试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

　　1.1.3 主要实验仪器 T6新世纪紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);超速离心机(北京医用离心机厂);水浴箱(0～100℃，杭州蓝天化验仪器厂)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MODS动物模型的制作 参照竞氏等法[4]。大鼠禁食过夜，200g/L的乌拉坦(1g/kg体重)腹腔内注射，麻醉成功后，取平卧位，固定于手术台上。右下腹备皮、消毒，开腹并寻见盲肠后，在其中远2/3处结扎，嵌闭远端肠腔，用16号针头于盲肠末端戳孔3处，向腹腔内挤出肠内容物少许后，将盲肠放回腹腔原位，嵌闭的盲肠内容物将持续向腹腔溢出，常规缝合腹壁切口。术后皮下注射50g/L葡萄糖生理盐水8mL，苏醒后能自由饮水进食者不再需皮下注射液体。

　　1.2.2 实验分组 SD大鼠随机分为5组，每组8只：①正常对照组，不做任何处理，即采血待测;②造模型后12h组，盲肠结扎并造瘘12h后采血待测;③造模型后24h组，盲肠结扎并造瘘24h后采血待测;④给药保护12h组，在造模同时腹腔注射NaHS 15μmol/kg，12h后采血待测;⑤给药保护24h组，造模同时腹腔注射NaHS 15μmol/kg，24h后采血待测。

　　1.2.3 生化指标检测 经腹主动脉采血约5mL，3000r/min离心10min，取血清冻存待测。黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活力;硫代巴比妥酸法测定MDA含量;全自动分光光度仪测定血清ALT、CK、Cr值。测定过程按照试剂盒说明书操作。

　　1.2.4 组织形态学观察 采血后立即处死大鼠，取心、肝、肺、肾、小肠(距回盲部10cm处)组织，以100g/L多聚甲醛溶液室温下固定24h，300g/L蔗糖4℃过夜沉底，OCT包埋，恒冷箱冰冻切片，片厚10μm，室温干燥后常规HE染色。光镜下观察各器官组织学改变。由病理医师在未被告知标本分组的情况下，对每份标本进行定性评估，依损害程度分为正常和轻、中、重4级，分别对应评分0、1、2、3分。判定依据：①标本大体形态、淤血程度和色泽;②组织细胞损伤、坏死和炎细胞浸润程度;③黏膜脱落和血管扩张程度。标本大体正常，毛细血管轻度淤血，组织细胞轻度水肿为轻度损伤(1分);组织细胞大片气球样变，毛细血管扩张，内充满红细胞，可见炎细胞聚集，黏膜脱落为中度损伤(2分);组织细胞浓缩，大量炎细胞聚集，红细胞逸出血管外，黏膜断裂坏死为重度损伤(3分)。

　　1.2.5 统计学分析 实验数据以±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　MODS造模后12h组和24h组大鼠血清中各项生化指标与正常对照组相比均有显著性变化(P<0.01)，尤其是造模型后24h组，大鼠血清各项生化指标检测结果符合MODS诊断标准[5]。

　　2.1 h3S对血清SOD、MDA、GSHPx活性的影响 与正常组相比，MODS模型组SOD和GSHPx明显降低。与MODS模型组相比，h3S保护组大鼠血清中SOD、GSHPx活性均明显升高，而MDA则明显降低(P<0.05，表1)。表1 h3S对MODS大鼠血清中氧化指标的影响*P<0.01 vs. normal group; ▲P<0.05 vs. model group at the same time

　　2.2 h3S对血清ALT、CK和Cr的影响 与正常组相比，MODS模型组ALT、CK和Cr明显升高;与MODS模型组相比，h3S保护组大鼠血清中ALT、CK、Cr水平显著降低(P<0.05，P<0.01，表2)。表2 h3S对MODS大鼠血清中器官损伤相关生化指标的影响

　　2.3 h3S对大鼠器官损伤综合评分的影响 与正常组相比，MODS模型组大鼠心、肝、肺、肾、小肠的器官损伤综合评分均显著升高(P<0.01);与同时间模型组相比，h3S则能明显降低大鼠心、肝、肺、肾、小肠的器官损伤综合评分(P<0.05，表3)。

　　2.4 大鼠组织病理学改变 与正常组相比，MODS造模后大鼠肺、肝、肾、小肠均有不同程度的损害，24h模型组器官损害严重。肺可见肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡腔内有漏出红细胞，还可见含铁血黄素细胞(心衰细胞);肺间质水肿增厚，炎性细胞成片形浸润;细支气管纤毛断裂、脱落等(图1A)。肾小管严重水肿，管腔闭塞，肾小球因血流减少萎缩变小(图1C)。小肠黏膜大片坏死，断裂脱落，黏膜下可见大量炎性细胞聚集(图1E)。肝细胞弥漫性气球样变伴点状坏死，肝组织内淤血，可见炎细胞浸润(图1G)。

　　与MODS造模24h组比较，给药保护24h组大鼠的肺、肝、肾、小肠损伤均有不同程度的减轻。肺组织充血较前者明显减轻，仅见少量炎性细胞局限性浸润，肺间质明显减轻(图1B);肾脏仅显示炎细胞浸润，肾小管轻度水肿，肾小球形态大致正常(图1D);小肠黏膜水肿样变，轻度坏死，绒毛形态较规则(图F);肝组织水肿较轻，少见坏死灶，细胞形态大致正常(图1H)。表3 各组大鼠的器官损伤综合评分

　　3 讨 论

　　MODS的诱因可分为感染性和非感染性，其中感染性约占70%。危重患者MODS发生率高，临床治疗效果不理想，死亡率可达40%～98%[6]。目前MODS的发病机制尚不完全清楚，可能与下列原因有关：机体内炎症反应与抗炎反应系统失衡;效应细胞分泌的炎症介质产生“瀑布式”级联放大炎症效应，诱发组织缺血缺氧;实质细胞变性坏死及凋亡，器官生理功能丧失。强烈的炎症反应，可造成组织内缺血缺氧，细胞内有氧代谢受到抑制，ATP合成急剧下降，加之无氧代谢产生的有毒酸性产物和氧自由基大量累积，导致细胞内酶活性的改变以及维持跨膜离子梯度的能量缺乏。当严重缺血时可使细胞内环境紊乱，甚至细胞死亡，继而出现器官功能衰竭[7]。本实验采用盲肠结扎造瘘致腹腔持续性感染引发大鼠MODS，符合临床感染性MODS的发病特点。

　　目前，国内对于MODS治疗方面的研究多着重于中医中药，如大黄、清开灵、热毒清等的使用[8]。如能针对MODS的发病特点，保护并提高体内抗氧化酶系统，提高氧自由基团清除效率，减轻其介导的细胞损伤作用，增强机体抗炎反应能力，则可能更有效地防治或缓解MODS的发生和发展。

　　内源性h3S可以提高内源性抗氧化酶系统的活性，其中SOD能催化O2歧化为h3O2，继而在GSHPx作用下h3O2降解为h3O和O2，胱硫醚γ裂解酶(cystanthionineγsplitting enzyme， CSE)是谷胱甘肽(GSH)合酶的关键酶。h3S使各内源性抗氧化酶不同程度升高，降低了脂质过氧化，减少其产物MDA的生成。h3S可以通过增加内源性抗氧化酶系统活性，直接去除部分的自由基，达到抗炎和器官保护作用，还对血管平滑肌有松弛作用[1，9]，从而可改善炎症时组织的缺血缺氧。h3S对胃肠道平滑肌也有一定的松弛作用，可缓解平滑肌痉挛[10]。有研究表明，通过提高机体内的h3S水平，可对心肌、肝肺缺血再灌注损伤有不同程度的保护作用。我们近期研究发现外源性h3S对大鼠肠缺血再灌注损伤具有明显的保护[3]。

　　内源性h3S可由多种细胞酶促产生，其底物为含硫氨基酸，主要是半胱氨酸，而其限速酶主要是磷酸吡多醛5′磷酸依赖性酶，包括胱硫醚β合成酶(cystanthionineβsynase， CBS)、CSE，且作为终产物的h3S对这些酶具有负反馈作用[2，11]。同为内源性气体分子的CO则可以上调CBS的表达，促进h3S的合成[12]。CBS和CSE的表达呈组织特异性，心血管组织内源性h3S主要由CSE催化产生。CSE mRNA在各血管组织中的表达量也不尽相同，依程度高低排序为肺动脉、主动脉、尾动脉、肠系膜动脉，h3S的内源产生量亦因血管类型不同而异。以往认为CSE在血管组织中的表达仅限于平滑肌细胞，但最新研究报道，肺动脉内皮细胞中也有CSE mRNA的表达。有研究表明h3S可直接作用于K(ATP)通道实现对血管的调节作用，并抑制平滑肌细胞的增殖，调节血管平滑肌的张力[13]。

　　本实验以NaHS作为外源性h3S供体，研究h3S对MODS大鼠受损脏器的保护作用。NaHS在体内离解为Na+及HS，后者与体内H+结合生成h3S。h3S具有脂溶性，可自由通过细胞膜而起到细胞介质作用。实验结果表明，h3S保护组和相应对照组比较，h3S可明显提高MODS大鼠血清SOD、GSHPx活性，降低MDA活性及血清ALT、CK、Cr水平，起到抗炎和器官保护作用。组织病理学观察显示，MODS模型给药后，其器官损伤程度明显减轻。由此可见，h3S对MODS大鼠受损脏器具有保护作用。但h3S对人MODS是否具有保护作用，以及其具体的作用机制、毒副作用等仍需进一步研究。

参考文献

　　[1]ZHAO WM， WANG R. h3Sinduced vasorelaxation and underlying cellular and molecular mechanisms [J]. AJPHC Physiol， 2002， 283(2):474480.

　　[2]FU ZF， LIU XM， GENG B， et al. Hydrogen sulfide protects rat lung from ischemiareperfusion injury [J]. Life Sci， 2008， 82(2324):11961202.

　　[3]刘浩，白晓斌，史松，等. 硫化氢对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2007， 28(6):668671.

　　[4]竞花兰，李艳容，姜富学，等. MODSE模型的生理生化学及组织学研究 [J]. 中国法医学杂志， 2003， 18(5):262265，268.

　　[5]胡森，盛志勇，薛丽波，等. 多器官功能障碍综合征动物模型的系列研究 [J]. 解放军医学杂志， 1996， 21(1):59.

　　[6]王超，苏强，张淑文，等. 多器官功能衰竭综合症病情严重度评分及预后评估系统在预测住院死亡率中的作用 [J]. 中华创伤杂志， 2006， 22(8):574578.

　　[7]GAO CJ， CHAI W， XU LX， et al. Protective effects of hyperoxygenated solution preconditioning on intestinal ischemiareperfusion injury in rabbits [J]. J Sur Res， 2006， 135(2):268274.

　　[8]王春荣，刘学飞，程永刚. 肠功能恢复汤对感染性多器官功能障碍综合征大鼠肠黏膜损伤的保护作用 [J]. 郑州大学学报(医学版)， 2008， 43(6):11071111.

　　[9]CHENG YQ， NDISANG JF， TANG GH， et al. Hydrogn sulfideinduced relaxation of resistance mesenteric artery beds of rats [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2004， 287(5):23162323.

　　[10]DOMBKOWSKI RA， RUSSELL MJ， OLSON KR， et al. Hydrogen sulfide as an endogenous regulator of vascular smooth muscle tone in trout [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2004， 286:678685.

　　[11]ROCHETTE L， VERGELY C. Hydrogen sulfide (h3S)， an endogenous gas with odor of rotten eggs might be a cardiovascular function regulator [J]. Ann Cardiol Angeiol (Paris)， 2008， 57(3):138138.

　　[12]HAN Y， QIN J， CHANG XZ， et al. Hydrogen sulfide and carbon monoxide are in synergy with each other in the pathogenesis of recurrent febrile seizures [J]. Cell Mol Neurobiol， 2006， 26(1):101107.

　　[13]WANG R. Twos company， threes a crowd: can h3S be the third endogenous gaseous transmitter [J]? FASEB， 2002， 16 (16):17921798