β肾上腺素能受体阻断剂诱导胰腺癌细胞株PC2凋亡的实验研究

　　　　　　作者：张东，马清涌，沙焕臣，胡恒通，郭坤

【摘要】 目的 观察β肾上腺素能受体阻断剂是否通过诱导胰腺癌细胞凋亡而产生抑制效应。方法 利用特异性β1肾上腺素能受体阻断剂美托洛尔、广谱β肾上腺素能受体阻断剂普萘洛尔、特异性β2肾上腺素能受体阻断剂丁氧胺干预诱导人胰腺癌PC2细胞。RTPCR和Western blot检测PC2细胞β受体的表达。用Hoechst 33342荧光染色，TUNEL染色和Annexin VFITC/PI流式细胞仪观察和分析PC2细胞凋亡情况，用Western blot检测Caspase3，Caspase9和Caspase8的表达。结果 PC2细胞表达β1和β2肾上腺素受体，尤以β2受体的表达占优势。Hoechst 33342荧光染色、TUNEL染色和流式细胞仪分析表明三种受体阻断剂均诱导了PC2细胞的凋亡，TUNEL染色法结果显示丁氧胺诱导的细胞凋亡率[(15.4±1.99)%]强于普萘洛尔[(11.25±1.95)%]，而普萘洛尔诱导的细胞凋亡率优于美托洛尔[(7.62±1.46)%]。流式检测结果显示丁氧胺诱导的细胞凋亡率[(16.2±1.58)%]优于普萘洛尔[(14.7±1.96)%]，而普萘洛尔诱导的细胞凋亡率高于美托洛尔[(6.29±1.77)%]。Western blot分析显示三种受体阻断剂诱导了Caspase3和Caspase9活性片段的表达，而Caspase8未受影响。结论 β肾上腺素能受体阻断剂可诱导胰腺癌细胞凋亡，主要是通过阻断β2受体发挥内源性凋亡效应。

【关键词】 β肾上腺素能受体;胰腺癌细胞;普萘洛尔;凋亡

　　ABSTRACT: Objective To observe whether βadrenoceptor antagonists can produce inhibitory effects by inducing apoptosis of pancreatic cancer (PC2) cells. Methods The β1adrenoceptor antagonist metoprolol， βadrenoceptor antagonist propranolol and β2adrenoceptor antagonist butoxamine were used to induce apoptosis in PC2 cells. The mRNA and protein expressions of β1 and β2adrenoceptors were analyzed by RTPCR and Western blotting. The apoptosis index was determined by Hoechst 33342 fluorescent staining， TUNEL and Annexin V and FITC/PI FCM assay. The expressions of Caspase3， Caspase9 and Caspase8 were analyzed by Western blotting. Results PC2 cell line expressed mRNA and protein for both of β1 and β2adrenoceptors. The Hoechst staining， TUNEL and FCM assay showed that the three drugs increased the number of apoptotic cells; TUNEL assay indicated that the rate of apoptosis was the highest using butoxamine (15.4±1.99)% followed by propranolol (11.25±1.95)%， while the least was using metoprolol (7.62±1.46)%. FCM assay showed that the rate of apoptosis was the highest using butoxamine (16.2±1.58)%， followed by propranolol (14.7±1.96)%， while the least was using metoprolol (6.29±1.77)%. βadrenoceptor antagonist therapy affected Caspase3 and Caspase9 fragment expression， but not Caspase8. Conclusion It is suggested that βadrenoceptor antagonists induce apoptosis of PC2 cells through inhibiting β2adrenergic receptor mainly.

　　KEY WORDS: βadrenoceptor; pancreatic cancer cell; propranolol; apoptosis

　腺癌是一种较常见的恶性肿瘤，目前尚无有效的筛查或早期诊断方法，确诊时往往已有转移，手术切除率低、预后差，死亡率几乎接近其发病率。2008年美国胰腺癌新发病例37680例，占全部恶性肿瘤新发病例的3%，同年胰腺癌死亡例数为34290，与发病例数接近，占全部恶性肿瘤死亡的6%，位居恶性肿瘤死亡的第4位[1]。近年来研究发现，β受体与胰腺导管腺癌的发生发展有着密切的关系。β受体激动剂可以有效地刺激Panc1和BxPC3等胰腺癌细胞株的增殖，其作用主要是通过激活Ras和促分裂原活化蛋白激酶通路(MAPKs)和cAMP/PKA通路，从而促使胰腺癌细胞的增殖[3]。本课题组旨在通过β受体阻滞剂抑制对胰腺癌细胞的诱导，研究胰腺癌细胞的凋亡情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司;TUNEL试剂盒购自Roche Diagnostic公司;β受体阻断剂美托洛尔、普萘洛尔和丁氧胺购自Sigma Chemical公司;MTT试剂和Hoechst 33342试剂购自Sigma Chemical公司;反转录试剂盒购自Fermentas Life Science公司;β1和β2单克隆抗体，Caspase3，Caspase9和Caspase8单克隆抗体购自Abcam公司。

　　1.2 胰腺癌细胞株PC2的培养 人胰腺导管上皮腺癌细胞株PC2购自中国协和医科大学，BxPC3细胞购自美国ATCC公司。使用DMEM高糖培养基和100mL/L胎牛血清的全培养基培养细胞，将细胞于37℃、50mL/L CO2培养箱中常规培养。

　　1.3 RTPCR鉴定受体mRNA的表达 用Trizol法提取PC2和BxPC3细胞的总RNA。引物设计：β1AR上游引物：5′GGGAGAAGCATTAGGAGGG3′，下游引物：5′CAAGGAAAGCAGGTGGG3′，扩增片段270bp;β2AR上游引物：5′CAGCAAAGGGACGAGGTG3′，下游引物：5′AAGTAATGGCAA AGTAGCG3′，扩增片段334bp。逆转录后，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃变性1min，62℃退火1min，70℃延伸2min，循环35次。琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.4 细胞增殖实验 利用MTT法检测细胞增殖。于96孔培养板内接种1×104个对数生长期的细胞，细胞生长于全培养基中，于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。24h后分别加入不同浓度的肾上腺素、普萘洛尔和5氟尿嘧啶，24h后每孔加入MTT试剂20μL，4h后弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，10min后利用酶标仪进行检测。

　　1.5 细胞凋亡的检测

　　1.5.1 Hoechst 33342荧光染色法 将多聚甲醛处理过的盖玻片置24孔板中，然后将5×104个对数生长期的细胞接种于24孔培养板内，细胞生长于全培养基中，培养于37℃、50mL/L CO2培养箱中。利用100μmol/L普萘洛尔干预细胞24h，用10μg/mL Hoechst 33342染料孵育细胞，4℃过夜，荧光显微镜下观察、计数并照相。

　　1.5.2 TUNEL法 将多聚甲醛处理过的盖玻片置于24孔板中，于24孔培养板内接种5×104个对数生长期的细胞，细胞生长于全培养基中，培养于37℃、50mL/L CO2培养箱中。利用100μmol/L美托洛尔、100μmol/L普萘洛尔和100μmol/L丁氧胺干预细胞24h，利用TUNEL试剂盒处理细胞并染色，显微镜下观察、计数并照相。

　　1.5.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 利用100μmol/L美托洛尔、100μmol/L普萘洛尔和100μmol/L丁氧胺干预细胞24h后，收获细胞，冷PBS液洗细胞两次，离心后弃去PBS液。每离心管内加入150μL缓冲液，并将细胞吹打开移到流式管内，每管加入annexin VFITC 5μL和PI 10μL，避光孵育15min后，上机检测。

　　1.6 Western Blot RIPA法裂解并提取蛋白，并用BCA分析法测定蛋白浓度。SDSPAGE凝胶电泳约2h后，半干转1.5h，然后使用含一抗的封闭液4℃孵育过夜。次日二抗封闭液室温孵育2h，洗膜，DAB显色，照相并分析结果。

　　1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。数据用±s表示，采用单因素方差分析和KruskalWallis秩和检验，以P<0.05表示为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 β受体mRNA和蛋白水平的表达 利用BxPC3细胞作为对照，人胰腺癌PC2细胞表达β1和β2受体(图1)，且β2受体的mRNA和蛋白表达水平高于β1受体。

　　2.2 不同β受体阻断剂对细胞增殖的作用 随着药物浓度的增加，肾上腺素可刺激胰腺癌PC2细胞的增殖。和对照组相比较，肾上腺素在150～200μmol/L浓度达到最佳增殖效应(P<0.05;图2)。相反，广谱的β受体阻断剂普萘洛尔对胰腺癌细胞产生抑制效应，与对照组比较，在100μmol/L浓度达到最佳抑制效应，利用5氟尿嘧啶作对照，β受体阻断剂普萘洛尔的抑制效率低于5氟尿嘧啶(P<0.05;图3)。利用MTT试验，获得最佳抑制浓度为100μmol/L。

　　图1 人类胰腺导管上皮细胞株PC2 细胞β1和β2 肾上腺素能受体mRNA和蛋白表达情况

　　Fig.1 Expression of mRNA and protein for β1 and β2adrenoceptors in the human ductal pancreatic adenocarcinoma cell line PC2 by RTPCR and Western blotting

　　A：β1受体：1：βactin;2：PC2细胞β1受体和βactin扩增产物;3：PC2 β1受体扩增产物;4：BxPC3细胞β1受体扩增产物;5：BxPC3 细胞β1受体和βactin扩增产物;6：βactin扩增产物;M：50bp DNA marker：β2受体：1：βactin;2：PC2细胞β2受体和βactin扩增产物;3：PC2细胞β2受体扩增产物;4：BxPC3细胞β2受体扩增产物;5：BxPC3细胞β2受体和βactin扩增产物;6：βactin;M：50bp DNA marker;B：Western blot结果显示：β1和β2受体分别表达64ku和95ku单条条带;C：PC2和BxPC3细胞β1和β2受体mRNA表达情况。2.3 不同方法检测细胞凋亡的结果

　　2.3.1 Hoechst荧光染色检测细胞凋亡 利用β受体阻断剂普萘洛尔干预细胞24h，与空白对照组[(2.3A、B：普萘洛尔处理组;C：对照组。2.3.2 TUNEL分析法检测细胞凋亡 利用β1受体阻断剂美托洛尔(metoprolol)、广谱β受体阻断剂普萘洛尔(propranolol)和β2受体阻断剂丁氧胺(butoxamine)干预细胞24h，TUNEL 分析法检测凋亡阳性细胞并计数。结果显示，普萘洛尔诱导凋亡率[(11.25±1.95)%]低于特异性β2受体阻断剂丁氧胺[(15.4±1.99)%]，但高于特异性β1受体阻断剂美托洛尔[(7.62±1.46)%](图5)。

　　A：100μmol/L丁氧胺;B：100μmol/L普萘洛尔;C：100μmol/L美托洛尔;D：对照组。与对照组比较，*P<0.05。

　　2.3.3 流式细胞仪检测凋亡率 三种β受体阻断剂干预细胞24h，利用annexin VFITC和PI染色，流式细胞仪检测，其中分布于FITC+/PI区域的细胞为早期凋亡细胞。美托洛尔、普萘洛尔和丁氧胺诱导胰腺癌PC2细胞早期凋亡率分别是(6.29±1.77)%、(14.7±1.96)%和(16.2±1.58)%。普萘洛尔诱导凋亡率[(14.7±1.96)%]低于特异性β2受体阻断剂丁氧胺[(16.2±1.58)%]，但高于特异性β1受体阻断剂美托洛尔[(6.29±1.77)%](图6)。

　　2.4 Caspase3、Caspase9和Caspase8的表达 三种β受体阻断剂诱导胰腺癌PC2细胞凋亡，其中Caspase3、Caspase9的激活片段表达升高，而Caspase8未见激活片段的表达。β受体阻断剂普萘洛尔诱导表达Caspase3和Caspase9低于丁氧胺，但高于美托洛尔(图7)。

　　3 讨 论

　　本组数据显示，β受体激动剂肾上腺素诱导胰腺癌PC2细胞增殖呈剂量依赖效应，β受体阻断剂具有抑制胰腺癌细胞增殖的作用，且在100μmol/L浓度达到最佳抑制效应，这种抑制作用可能是通过诱导胰腺癌细胞凋亡而实现的。

　　三种β受体阻断剂干预胰腺癌PC2细胞并诱导出不同程度的凋亡效应，广谱的β受体阻断剂普萘洛尔诱导凋亡的效率弱于特异性β2受体阻断剂丁氧胺，而强于特异性β1受体阻断剂美托洛尔。实验结果反映出儿茶酚胺类神经递质在调节胰腺癌增殖和凋亡中，主要是通过β2受体发挥调节作用。首先，本文结果显示PC2细胞同时表达β1和β2肾上腺素能受体，但β2受体在mRNA和蛋白水平的表达高于β1受体(图1)。国外文献报道在Panc1和BxPC3细胞中也存在β1和β2受体的表达，同时β2受体的表达占大约65%，而β1受体表达只占35%，此结论和本实验结果相符合[2]。这预示了β受体阻断剂主要是与β2受体结合发挥阻断和抑制作用，从而诱导凋亡。其次，胰腺癌β肾上腺素能受体有别于心血管系统中Fig.7 Expressions of Caspase3， Caspase9 and Caspase8 in PC2 cells treated with βadrenoceptor antagonist的β受体，在低分化肿瘤中常有突变存在，主要是β2受体的突变，使其具有对配体的高亲和力。丁氧胺是特异性的β2受体阻滞剂，具有反向激活作用，不但自然拮抗，而且抑制PKA、EGFR和Ras信号传导通路。对于β2受体高亲和力的特点，丁氧胺与β2受体结合充分抑制β2受体，本研究结果显示其促凋亡效果优于普萘洛尔和美托洛尔，提示单纯阻滞β2受体的效果要优于单纯阻断β1受体，同时，单纯高效的阻滞β2受体的效果要优于β1和β2受体同时阻断，这说明三种药物的阻滞效率和细胞对药物的敏感性不同所致。再次，Kiras基因的突变在胰腺癌中是普遍存在的[4]，β2受体阻滞剂可阻断Ras和Src酪氨酸激酶依赖的MAPKs通路。另外，β2受体阻滞剂可抑制β受体的转激活表皮生长因子受体 (EGFR) 的能力，导致了胰腺癌细胞抗凋亡能力下降[67]。

　　在本实验中，β受体阻断剂诱导胰腺癌PC2细胞凋亡，Caspase3、Caspase9的激活片段表达升高，而Caspase8未见激活片段的表达(图7)。此结果证明β受体阻断剂诱导细胞凋亡可能是通过激活内源性凋亡通路实现的。β2受体阻滞剂可以阻断Ras和Src酪氨酸激酶依赖的MAPKs通路和PI3KAkt通路，从而抑制Erk和Akt磷酸化，促使线粒体细胞色素C的释放并且激活Caspase9和Caspase3，产生凋亡作用[89]。

　　基于以上原因，β2受体在调节胰腺癌PC2细胞凋亡效应中发挥着重要作用，其阻滞剂诱导凋亡的效应显著高于β1受体阻滞剂，可能为β2受体阻断剂应用于胰腺癌的预防和治疗提供了相关证据。β受体阻断剂已经广泛应用于高血压和动脉粥样硬化的治疗，相关报道表明吸烟、高血脂、心理应激都成为胰腺癌发生的危险因素[10]，而这些危险因素也和心血管系统疾病密切相关。近期流行病学和实验研究资料提示，β2肾上腺素能信号通路可能成为未来胰腺癌预防和治疗的分子靶点。故应用β2受体阻断剂可能对胰腺癌的预防和治疗起一定作用。

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