锂对慢性铝暴露大鼠脑内CDK5和PP2A表达的影响

　　　　 作者：陆文惠，屈秋民，曹红梅

【摘要】 目的 研究锂对慢性铝暴露大鼠脑内周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)表达的影响，进一步探讨锂抑制tau蛋白磷酸化的作用机制。方法 慢性铝暴露大鼠12只，随机分为锂治疗组和非治疗组。锂治疗组给予氯化锂[200mg/(kg·d)]溶液连续灌胃6周;非治疗组以等量生理盐水灌胃。另取6只同月龄非铝暴露大鼠为正常对照组。Morris水迷宫测试3组大鼠学习记忆功能;Western blotting检测大鼠大脑皮层及海马磷酸化tau蛋白、CDK5、PP2A的表达。结果 慢性铝暴露非治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量、CDK5表达明显高于正常对照组大鼠(P<0.05)，且慢性铝暴露非治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量与CDK5表达呈正相关(r=0.702，P=0.036)。锂治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量、CDK5表达明显低于非治疗组(P<0.05)，且锂治疗组大鼠脑内CDK5表达与磷酸化tau蛋白含量呈正相关(r=0.871，P=0.024)，而正常组、锂治疗组和非治疗组大鼠皮层及海马PP2A含量无明显差异(P>0.05)。结论 抑制脑内CDK5表达可能是锂降低tau蛋白过度磷酸化，减少大鼠脑内神经原纤维缠结的又一途径。

【关键词】 阿尔茨海默病;锂;tau蛋白磷酸化;周期蛋白依赖性激酶5;蛋白磷酸酯酶2A

　　: Objective To explore the effects of lithium on expressions of cyclindependent kinase 5 (CDK5) and protein phosphatase 2A (PP2A) in the brains of chronic aluminum exposure rats so as to further understand the mechanism of lithiums inhibition on tau phosphorylation. Methods We pided 12 chronic aluminum chloride exposure rats into treatment group and nontreatment group (6 rats in each). Treatment group was given lithium chloride (200mg/kg·d) via gastric perfusion daily for 6 weeks， while the nontreatment group sodium chloride at the same dosage and the normal group (6 nonaluminum exposure rats of the same month old) without intervention. Six weeks later， all the rats received Morris water maze test for learning memory function; CDK5 and PP2A expressions and phosphorylated tau protein level in rat hippocampus were determined by Western blotting. Results Compared with normal group， nontreatment of chronic aluminum exposure group showed higher phosphorylated tau protein level and CDK5 expression in the brain (P<0.05)， and the level of phosphorylated tau had a significantly positive correlation with CDK5 expression (r=0.702， P=0.036). After 6 weeks treatment with lithium， phosphorylated tau protein and CDK5 expression decreased significantly in the brain compared with those in nontreatment group (P<0.01). Moreover， phosphorylated tau had a significantly positive correlation with the expression of CDK5 (r=0.871， P=0.024) in lithium treatment group. There was no significant difference in PP2A expression among treatment group， nontreatment group and normal group (P>0.05). Conclusion Lithium may reduce tau phosphorylation and neurofibrillary tangle formation by inhibiting the expression of CDK5.

　　KEY WORDS: Alzheimers disease; lithium; tau phosphorylation; cyclin dependent kinase 5; protein phosphatase 2A

　　神经原纤维缠结(NFT)是阿尔茨海默病(Alzheimers disease， AD)的特征性病理改变之一，而NFT的主要成分是过度磷酸化的微管相关tau蛋白。生理情况下，tau蛋白的磷酸化水平受蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶活性调节而维持平衡。蛋白激酶的异常激活，或/和蛋白磷酸酯酶活性降低，均可导致tau蛋白过度磷酸化，过度磷酸化的tau蛋白呈螺旋状扭曲即形成NFT[1]。周期蛋白依赖性激酶5(cyclin dependent kinase 5， CDK5)和蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A， PP2A)分别是脑内重要的蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶，在许多蛋白的磷酸化调节中发挥着重要作用[23]，但其是否参与脑内tau蛋白磷酸化调节尚不明确。

　　锂是常用的双向性精神障碍调节剂。近年研究发现，锂能够保护Aβ诱导的神经元死亡，特异性抑制糖原合成酶激酶3β(GSK3β)，减少脑内Aβ沉积，降低tau蛋白磷酸化[46]。动物实验显示，锂可以改善大鼠学习记忆功能[7];临床研究显示，长期接受锂治疗患者MMSE评分较高，痴呆发生率较低，提示锂对于防治AD具有潜在作用[89]。但是除了抑制GSK3β外，锂是否通过调节CDK5和PP2A表达影响tau蛋白磷酸化尚不清楚。为此，本研究观察了锂对慢性铝暴露大鼠脑内CDK5和PP2A表达的影响，探讨锂是否通过调节CDK5和PP2A表达而抑制tau蛋白磷酸化。

　　1 材料与方法

　　1.1 慢性铝暴露大鼠的制备 10月龄雌性SD大鼠78只(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，按100mg/(kg·d)给予氯化铝溶液连续灌胃[10]，100d后所有大鼠进行Morris水迷宫测试。其中穿越站台次数较正常组减少20%以上，且平均潜伏期较正常组延长20%以上者定义为学习记忆障碍大鼠，共有24只。

　　1.2 氯化锂干预处理 24只学习记忆障碍大鼠中随机选择12只，分为锂治疗组和非治疗组，每组6只。锂治疗组大鼠按文献[10]介绍剂量给予氯化锂溶液连续灌胃[200mg/(kg·d) LiCl]，治疗时间为6周。非治疗组用等量生理盐水平行灌胃。

　　1.3 Morris水迷宫测试 按文献[11]报道的Morris水迷宫测试方法进行。摄像采集系统(北京隆冠科技有限公司)记录大鼠活动情况;Morris动物行为实验软件(中国科学院心理研究所)计算平均潜伏期、搜索策略、穿越站台次数以及在站台象限停留时间，以判断大鼠学习记忆能力。

　　1.4 脑蛋白的提取 实验大鼠快速断头取脑，冰上剥去脑膜，留取海马及皮层装入冻存管内，液氮浸泡1min后，置-80℃冰箱保存备用。将冰冻脑组织放入匀浆管内，按每克脑组织4mL比例加入裂解液(25mmol/L Hapes/Na、2mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、0.1mmol/L PMSF，pH=7.4)，400r/min于4℃匀浆15min。匀浆液以10000g转速离心10min，提取上清液即为制备的脑蛋白提取物。

　　1.5 Western blotting Bradford法测定上清液中蛋白质浓度。每孔取20μg蛋白质与等容积2×上样缓冲液混匀上样，以150g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干电转移法转膜，室温下用封闭液封闭1h，1∶200的CDK5蛋白抗体或1∶100的PP2A蛋白抗体或1∶100的tau蛋白抗体4℃过夜，1∶1000稀释羊抗兔碱性磷酸酶二抗(武汉博士德公司)反应1h，BCIP/NBT试剂盒显色。利用Gel Doc2000型自动凝胶成像分析系统及Quantity one图像处理分析软件处理。

　　1.6 统计学处理 全部数据用SPSS11.0软件包进行统计处理。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(经检验符合正态分布)，相关性检验采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量及CDK5、PP2A表达的变化 为了观察慢性铝暴露对大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量及CDK5、PP2A表达的影响，我们取慢性铝暴露大鼠皮层及海马提取蛋白质，进行Western blotting，自动凝胶成像分析系统测定目的蛋白条带吸光度(A值)。结果显示，慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量及CDK5明显高于正常对照组，而两组之间脑内PP2A含量无显著性差异(表1)。表1 慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量及CDK5、PP2A表达的变化

　　为了判断慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量增加是否与CDK5表达增高有关，我们以CDK5含量为自变量，以磷酸化tau蛋白含量为因变量进行相关分析。 结果发现，慢性铝暴露大鼠脑内CDK5表达与磷酸化tau蛋白含量呈正相关(r=0.702，P=0.036)，即随着CDK5表达增加，脑内磷酸化tau蛋白含量增高。

　　2.2 锂对铝暴露大鼠脑组织磷酸化tau蛋白含量及CDK5、PP2A表达的影响 为了观察锂治疗对慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量及CDK5、PP2A表达的影响，我们取锂治疗组大鼠及非治疗组大鼠皮层及海马提取蛋白质，应用Western blotting和自动凝胶成像分析系统测定目的蛋白条带A值。结果显示，锂治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量及CDK5明显低于非治疗组，而两组之间脑内PP2A含量无显著性差异(表2)。表2 锂对铝暴露大鼠脑组织磷酸化tau蛋白含量及CDK5、PP2A表达的影响

　　为了判断锂降低慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量是否与抑制CDK5表达有关，我们以CDK5含量为自变量，以磷酸化tau蛋白含量为因变量进行相关分析。 结果发现，锂治疗组大鼠脑内CDK5表达与磷酸化tau蛋白含量呈正相关(r=0.871，P=0.024)，即随着CDK5表达降低，脑内磷酸化tau蛋白含量也降低。

　　3 讨 论

　　尽管目前AD动物模型很多，但是尚无一个模型能完全模拟AD的全部病理改变。有学者将可溶性铝盐注入兔脑，发现可引起注射部位神经原纤维结构紊乱，同时免疫细胞化学染色发现与AD患者相似的神经原纤维缠结[13]。钱亦华等[10]研究证实，铝中毒痴呆模型大鼠皮层、海马区Aβ沉积明显增多，并可形成神经原纤维缠结，类似于AD的主要病理改变。本研究应用氯化铝连续灌胃100d，发现实验大鼠在Morris水迷宫测试中穿越站台次数较正常明显减少，而找到站台的平均潜伏期显著延长，即大鼠出现明显的学习记忆障碍，符合痴呆模型大鼠的行为学改变特征。Western blotting检测发现，慢性铝暴露大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量明显增高，证明慢性铝暴露大鼠部分模拟了AD脑内tau蛋白磷酸化过程。

　　磷酸化和去磷酸化是一个动态平衡过程，蛋白质的磷酸化水平受多种机制调节。CDK5和PP2A分别是脑内重要的蛋白磷酸激酶和蛋白磷酸酯酶，二者共同调节多种蛋白质的磷酸化过程[2]。本研究发现，氯化铝连续灌胃100d后，大鼠皮层、海马CDK5表达明显升高，且磷酸化tau蛋白水平与CDK5表达显著相关，提示铝可能通过诱导CDK5表达而促进tau蛋白磷酸化。由于慢性铝暴露大鼠皮层、海马PP2A含量与正常对照组无明显变化，提示PP2A可能与铝暴露引起的脑内tau蛋白磷酸化关系不大。

　　Tau蛋白过度磷酸化是神经原纤维缠结的物质基础，抑制tau蛋白磷酸化将减少脑内神经原纤维缠结，从而延缓AD病情进展。锂是GSK3β的特异性抑制剂，研究证明，锂可以抑制GSK3β表达，减少脑内tau蛋白磷酸化，降低神经原纤维缠结[1415]。本研究发现，慢性铝暴露大鼠腹腔注射氯化锂6周后，治疗组大鼠皮层、海马磷酸化tau蛋白表达明显下降，证明锂可以抑制大鼠脑内tau蛋白磷酸化。由于铝通过诱导CDK5表达，促进大鼠脑内tau蛋白磷酸化。因此，我们观察了锂抑制大鼠脑内tau蛋白磷酸化与CDK5表达的关系，结果发现锂治疗后，大鼠皮层、海马CDK5表达显著降低，且磷酸化tau蛋白含量与CDK5表达呈正相关，即锂治疗后随着CDK5含量降低，磷酸化tau蛋白含量相应降低，提示锂可能通过抑制CDK5表达，减少脑内tau蛋白磷酸化。由于锂治疗后大鼠皮层、海马PP2A含量无明显变化，提示锂抑制tau蛋白磷酸化可能与PP2A无关。

　　通过本研究发现，慢性铝暴露可诱导大鼠脑组织CDK5表达，促进tau蛋白磷酸化，而锂可抑制CDK5表达，减少脑内tau蛋白磷酸化。由于锂还可抑制GSK3β，降低脑内tau蛋白磷酸化，提示锂可能通过CDK5和GSK3β双重抑制，减少脑内神经原纤维缠结。因此，锂可能在AD防治中具有潜在的应用价值。

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