Ybox结合蛋白1在胃癌组织中的表达及意义

　　 作者：王国荣，车向明1，吴开杰，邱健，潘承恩，王晓强，何文宪

【摘要】 目的 研究Ybox结合蛋白1(YB1)在胃癌的不同发展阶段中的表达及其意义。方法 采用免疫组织化学和原位杂交方法检测正常胃组织、肠化生组织、早期胃癌和进展期胃癌组织中YB1蛋白和mRNA的表达变化。结果 在正常胃组织中YB1蛋白和mRNA无表达;在肠化生组织中可见YB1阳性染色于胃黏膜上皮细胞中，但表达较弱;在早期胃癌中YB1表达于全层胃黏膜上皮细胞中，染色较肠化生组织重，而在进展期胃癌中其表达较在早期胃癌中下降。结论 YB1的升高可能在胃癌的早期发生和发展中起作用。

【关键词】 胃癌;Ybox结合蛋白1;免疫组织化学;原位杂交

　ABSTRACT: Objective To investigate the expression and significance of Yboxbinding protein1(YB1) in patients with gastric carcinoma of different stages. Methods Expressions of YB1 protein and mRNA in specimens of normal tissues， intestinal metaplasia， early gastric cancer and advanced gastric cancer were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization. Results There was no positive staining of YB1 protein and mRNA in normal gastric tissues. However， YB1 was expressed in epithelial cells of gastric mucosa in intestinal metaplasia. YB1 was expressed in all layers of gastric mucosa of epithelial cells in the early stage of gastric cancer， and its expression was weaker in advanced gastric cancer than in early gastric cancer. Conclusion Elevated YB1 may be related to the early pathogenesis and development of gastric carcinoma.

　　KEY WORDS: gastric carcinoma; YB1; immunohistochemistry; in situ hybridization

　　胃癌为我国第2大恶性肿瘤[1]，且一旦确诊，大多已非早期，故手术和化疗的5年生存率均不高。Ybox结合蛋白1(YB1)属于Ybox结合蛋白家族成员之一，其最初是在HLADRB的增强子序列中被鉴定出来的[2]。YB1包括一个高度保守的核酸结合区域，称为冷休克区域[3]。研究表明，冷休克区域有多种生物学功能，包括基因的转录翻译、DNA的修复、RNA的配对、耐药性及细胞对外源性刺激的反应等[4]。YB1可在很大程度上通过核内调节因子亚单位NFYA和NFYB来影响MHCⅡ类基因的转录[5]。研究表明，YB1可被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt 磷酸化，该磷酸化使得YB1的mRNA5末端的结合力加强，从而使其易位活性增强，这也可能与细胞的增殖和转化相关[6]。

　　以上研究均表明，YB1在肿瘤细胞的增殖及肿瘤的发生、进展和预后中均发挥其生物学作用，但其在胃癌中的研究尚未见报道。因此，我们采用免疫组织化学和原位杂交的方法检测了YB1在胃癌组织中的表达情况，以探讨其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本采集 收集病理确诊手术切除的胃腺癌标本63例，其中早期胃癌25例，进展期胃癌38例;肠黏膜化生组织23例。以上患者无其他系统性疾病，在术前均未接受放射和化学治疗。21例正常组织来自胃镜活检组织。其中男12例，女9例;35～50岁者12例，51～72岁者9例。胃癌组与正常组的一般情况比较无显著差异性。

　　1.2 主要试剂 YB1多克隆抗体(5μg/mL)为日本学者赠送;原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物公司;YB1的探针序列为：5′>GCCGCTGCCCGTAG

　　TGCCGGGCTTGGTGTC<3′，地高辛标记，与人类其他基因无同源性。

　　1.3 方法

　　1.3.1 YB1的免疫组化定位 新鲜胃癌组织于100mL/L的甲醛溶液中固定48h，石蜡包埋;切片经脱蜡、水化后，用30mL/L双氧水孵育10min，以去除组织内固有的过氧化物酶。枸橼酸缓冲液修复抗原：92℃水浴15min，室温冷却1h;血清封闭液、卵白素封闭液和生物素封闭液各孵育15min，以去除非特异性染色。一抗4℃结合21h，二抗孵育40min，辣根过氧化物酶标记的链霉素复合物孵育30min，二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素复染。阴性对照用羊血清代替一抗或二抗。

　　1.3.2 原位杂交方法 参照文献所述[67]，步骤如下：活检组织经固定、包埋、切片、脱蜡、水化后，用30mL/L双氧水(DEPC配制)孵育10min，DEPC水洗6min;蛋白酶K 37℃消化30min，以去除阻碍探针结合的表面蛋白;PBS和DEPC各水洗6min;每片加预杂交液20μL，42℃孵育2h;加入13pmol/L的寡核苷酸探针20μL，42℃杂交22h;2×SSC和1×SSC液各洗15min;羊血清封闭液37℃封闭30min，生物素化的鼠抗地高辛37℃孵育30min，辣根过氧化物酶标记的链霉素复合物37℃孵育30min;DAB染色，苏木素复染。阴性对照用预杂交液代替杂交液。阳性判断标准：角质形成细胞中有棕黄色颗粒沉着，阴性无此沉着。

　　1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行统计分析。组间两两比较采用卡方检验和精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 YB1蛋白的表达情况 在正常组织中YB1蛋白无表达(图1A);在肠化生组织中可见YB1蛋白阳性染色于胃黏膜上皮细胞中，但表达较弱，不是所有的细胞均着色(图1B);在早期胃癌组织中，可见YB1蛋白表达于全层胃黏膜上皮细胞中(图1C);在进展期胃癌组织中，YB1蛋白的表达弱于早期胃癌组织(图1D)。

　　图1 正常胃组织、肠化生组织和胃癌组织中YB1蛋白的表达情况

　　Fig.1 Expression of YB1 in normal tissues， intestinal metaplasia and gastric carcinoma tissues (DAB， ×200)

　　A：正常组织中YB1无表达;B：肠化生组织中YB1阳性染色于胃黏膜上皮细胞中，但表达较弱;C：早期胃癌中YB1表达于全层胃黏膜上皮细胞中;D：进展期胃癌中YB1表达弱于早期胃癌。

　　2.2 YB1 mRNA的表达情况 mRNA的表达部位同蛋白。在正常组织中，YB1 mRNA在胃黏膜上皮细胞中未见表达(图2A);在肠化生组织中，可见YB1 mRNA阳性染色于胃黏膜上皮细胞中，但表达较弱，不是所有的细胞均着色(图2B);在早期胃癌组织中，可见YB1 mRNA表达于全层胃黏膜上皮细胞中(图2C);在进展期胃癌组织中，YB1 mRNA的表达弱于早期胃癌(图2D)。

　　图2 正常胃组织、肠化生组织和胃癌组织中YB1 mRNA的表达情况

　　Fig.2 Expression of YB1 mRNA in normal tissues， intestinal metaplasia and gastric carcinoma tissues (DAB， ×200)

　　A：正常组织中YB1 mRNA无表达;B：肠化生组织中YB1 mRNA阳性染色于胃黏膜上皮细胞中，但表达较弱;C：早期胃癌中YB1 mRNA表达于全层胃黏膜上皮细胞中;D：进展期胃癌中YB1 mRNA表达弱于早期胃癌。

　　2.3 YB1表达的结果分析 YB1在正常胃黏膜上皮细胞中的阳性率为9.5%(2/21)，而在肠化生组织、早期胃癌组织和进展期胃癌组织胃黏膜上皮细胞中的阳性率分别为70.0%(16/23)、92.0%(23/25)和76.3%(29/38)，与正常胃黏膜组织相比差异有统计学意义(P<0.01)，而进展期胃癌和肠化生组织之间YB1的阳性率无明显差异(P>0.05)。

　　2.4 YB1表达与胃癌临床病理指标的关系 YB1阳性表达与组织学分型(肠型vs.弥漫型，P<0.01)、胃壁浸润深度(P<0.01)及血管癌浸润(P<0.05)有密切的关系。多因素Logistic回归分析显示，YB1阳性表达率与胃癌的进展(早期、进展期，OR=0.272，95%，CI=0.106～0.922)及血管浸润明显相关(OR=0.253，95%，CI=0.075～0.915)。

　　2.5 YB1表达与患者预后的关系 在随访资料完整的病例中，41例患者术后生存时间超过5年，22例患者死亡。生存时间为52～4872d(平均2362d)。生存曲线显示，YB1的表达与患者的生存时间没有显著的相关性(P=0.538)。

　　3 讨 论

　　本研究结果显示，YB1在正常组织中为阴性表达，在癌周肠化生中为弱阳性表达，在早期胃癌中为强阳性表达，而在进展期胃癌中的表达下降;YB1阳性表达率在胃癌组织中明显高于癌周肠化生和正常黏膜组织(P<0.01)。相似的研究显示，一种肠特异性转录因子CDX2在正常胃黏膜中为阴性表达，在肠化生中为强阳性表达，在肠型胃癌中为弱阳性或阴性表达，因此认为CDX2是一种肠化生和胃癌形成的促进因素[7，1]。本研究结果还显示，在进展期胃癌中YB1的阳性率明显低于早期胃癌，与CDX2的表达有明显的相似性。我们推测YB1有可能同样与早期胃癌的发生、发展有关。

　　YB1蛋白表达定位于细胞质，呈现弥漫的细胞质染色，而仅在增殖区，除了上述表现外，部分病例出现散在的细胞核或核周的阳性表达，强度明显高于前者。分析原因，我们认为是一种异质性表达，可能涉及不同功能的表达。在其他的组织器官中，YB1蛋白以核蛋白的形式大量的表达，如乳腺癌、肺癌及肝癌[89]。核表达的YB1与多种癌性疾病的进展和化疗耐药有关[10]。正常情况下，YB1定位于细胞质中，当接受抗癌剂的治疗、高温或在紫外线的照射下，由细胞质进入细胞核中。相似的表达也发生在癌周的肠化生中。

　　多项研究表明，YB1可表达于非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、滑液肉瘤及骨肉瘤组织中，细胞核表达YB1者预后较差，而细胞质表达YB1者与预后没有关系。

　　综上所述，从正常胃组织肠化生组织早期胃癌进展期胃癌的演变过程中，YB1表达呈现逐渐升高而后下降的趋势。而其产生和增多有利于肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤的发生、发展。

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