生长分化因子5单核苷酸多态性与大骨节病的相关性

　　　　 作者：高晓云，周玉玲，于敏2，屠千千，武林楠，赖江华，郭雄

【摘要】 目的 探讨生长分化因子5(GDF5)基因3个单核苷酸多态性(SNP)位点多态性与大骨节病的关系。方法 用限制性核酸内切酶酶切方法对103例大骨节病患者和91例健康人的GDF5基因上的3个SNP位点进行基因分型，计算相应人群中3个位点的基因型频率，比较各组间基因型频率的差异。结果 单倍型重构分析显示单倍型AT、TGC和 TAT在大骨节病患者和健康人群之间存在差异，但3个位点单位点关联分析未显示与大骨节病具有相关性。结论 单倍型TGC与大骨节病具有相关性。

【关键词】 单核苷酸多态性;大骨节病;生长分化因子5

　　ABSTRACT: Objective To understand the association between the polymorphisms of three SNP loci of growth differentiation factor 5 (GDF5) gene and KashinBeck disease (KBD). Methods We classified the three SNP loci of GDF5 gene by PCRRFLP among the 103 KBD patients and 91 healthy controls， calculated and compared the genotypic frequency of the two groups to find the potential association between these polymorphisms and KBD. Results The haplotypes AT， TGC and TAT differed from those of the KBD patients and healthy controls. However， the correlation analysis based on single locus showed no significant association with KBD. Conclusion The polymorphism of haplotype TGC is associated with KBD.

　　KEY WORDS: single nucleotide polymorphism (SNP); KashinBeck disease; growth differentiation factor 5 (GDF5)

　　大骨节病(KashinBeck disease， KBD)是一种原因不明的地方性、变形性骨关节病。自1849年发现大骨节病以来，先后提出了环境硒缺乏、粮食真菌污染及其毒素中毒等多种假说[12]。然而，至今大骨节病的发生发展仍不能完全用这些环境病因假说解释。近年来的研究认为，绝大多数人类的疾病是环境因素和基因相互作用的结果。因此，长期暴露在大骨节病环境有害因素中的人群，可能会启动机体内一些与软骨发育相关的环境反应基因而引发本病。大骨节病具有一定的家庭聚集性[3]，且GDF5基因5′非翻译区域的一个单核苷酸基因多态性(+104T/C;rs143383)与骨性关节炎的发生相关，含有104C的等位基因转录能力下降[4]。因此，根据已获得的骨关节病易感基因、软骨胶原表型表达、细胞分化异常、凋亡与软骨细胞坏死的研究进展，本次研究对GDF5基因3个SNP位点与大骨节病的相关性进行了探索性研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选择陕西省麟游县、永寿县大骨节病区人群，按照《大骨节病诊断标准》诊断或排除研究对象，确定194名作为本次调查的研究对象，其中大骨节病病例组103例，对照组91例。研究对象均为无关个体，组间年龄、性别无显著性差异(P>0.05，表1)。表1 KBD病例组与对照组特征的比较

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 标本收集及基因组DNA的提取 采集每例观察对象外周静脉血2mL，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝备用。采用美国Promega公司生产的外周血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

　　1.2.2 SNP位点的选取及引物设计与合成 选取GDF5基因上的3个SNP位点作为研究对象，应用Primer5软件设计引物。所选3个SNP位点的引物序列如下，并由上海生物工程公司合成，rs143383 P1：CGAACCGACCTGGACCTTA;P2：TCTTACCGCATTACGACGGA;rs224334 P1：TCGTTAGTTCAGAGCCTT;P2：GGTCATACTGCGAGTTAGG;rs224329 P1：GAATAGATAGACGGGAACCC;P2：AGGAGATGGTGGTGTTGGAC。

　　1.2.3 使用PCR反应扩增目的片段 使用ABI9700热循环仪对目的片段进行扩增。反应总体积12.5μL，上、下游引物各0.5μL，基因组DNA 1.2μL，去离子水4μL，PCR Mix液6.3μL。循环参数：rs143383：94℃变性5min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，30个循环，72℃延伸10min。rs224334：94℃变性5min，94℃ 30s、54.1℃ 30s、72℃ 30s，30个循环，72℃延伸10min。rs224329：94℃变性5min，94℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 30s，30个循环，72℃延伸10min。

　　1.2.4 3个SNP位点目的片段的酶切反应 运用美国NEB公司在线酶切位点分析工具设计酶切位点。所用酶为：rs143383 BsiEⅠ;rs224334 Hind Ⅲ;rs224329 Hpy166Ⅲ。实验所用酶BsiEⅠ和Hpy166Ⅲ购买自美国NEB公司，Hind Ⅲ购买自西安润德生物技术有限公司。PCR扩增后，直接取扩增产物进行酶切。酶切体系为，rs143383：10×NEB buffer 2μL，PCR扩增产物10μL，100×BSA 0.2μL，BsiEⅠ酶0.5μL，ddh3O 7.3μL;60℃温育16h。rs224334：10×buffer R 2μL，PCR扩增产物10μL，Hind Ⅲ酶1μL，ddh3O 18μL;37℃温育16h;rs224329：10×NEB buffer 2μL，PCR扩增产物10μL，Hpy166Ⅲ酶0.5μL，ddh3O 7.5μL;37℃温育16h。取酶切产物8μL，20g/L琼脂糖凝胶电泳30～40min后紫外灯下观察结果。

　　1.3 统计学分析 使用PowerMarker软件对3个SNP位点的等位基因频率和基因型频率进行统计，并对两个位点进行HardyWeinberg(HW)平衡检验。使用Haploview软件进行单位点关联分析和重构单倍型关联分析。

　　2 结 果

　　2.1 3个SNP位点目的片段的酶切分型 rs143383位点PCR扩增产物总长为435bp，酶切位点位于99bp处，rs143383PCR产物酶切后可能会出现的条带有99、335和435bp。基因型为TT时酶切后只见435bp条带，基因型为CT时，酶切后可见99、335和435bp三个条带，基因型为CC时，酶切后可见99bp和335bp两个条带(图1)。

　　rs224334位点PCR扩增产物总长为263bp，酶切位点位于199bp处，PCR产物酶切后可能会出现的条带有63、199和263bp。基因型为GG时酶切后只见263bp条带，基因型为AG时，酶切后可见63、199和263bp三个条带，基因型为AA时，酶切后可见63bp和199bp两个条带(图2)。

　　rs224329位点PCR扩增产物总长为243bp，酶切位点位于193bp处，PCR产物酶切后可能会出现的条带有50、193和243bp。基因型为TT时酶切后只见243bp条带，基因型为CT时，酶切后可见50、193和243bp三个条带，基因型为CC时，酶切后可见50bp和193bp两个条带(图3)。

　　2.2 HW平衡检验的结果 rs143383和rs224334位点的哈迪温伯格检验结果显示P值均大于0.05，表明这2个位点在人群中的分布均符合哈迪温伯格平衡。但是，rs224329位点哈迪温伯格检验结果显示P<0.05(表2)。进一步对这一位点的大骨节病病例组和对照组分别进行哈迪温伯格检验，结果显示对照组P>0.05，而大骨节病病例组P<0.05。所以，推测大骨节病可能影响患者人群中的哈迪温伯格平衡(表3)。3个SNP位点的最小等位基因频率分别为0.291、0.151和0.334，均大于0.05，具有足够的信息量进行后续的关联分析。表2 SNP多态性位点HW检验结果及基本信息HWE：哈迪温伯格平衡;SNP：单核苷酸多态性。表3 rs224329位点病例组与对照组HW检验结果及基本信息

　　Tab.3 HW test results and basic information of rs224329 loci in case group and control group

　　组 别观测杂

　　合度期望杂

　　合度HWE最小等位

　　基因频率等位基因病例组0.2870.4360.001 20.322C>T对照组0.3650.4200.309 90.300C>T

　　HWE：哈迪温伯格平衡。

　　2.3 3个SNP位点的单位点的关联分析 大骨节病病例组和健康对照组之间基因型和等位基因的分布均无显著性差异(表4)。

　　2.4 3个SNP位点单倍型的关联分析 利用最大似然法对GDF5基因rs143383和rs224334位点及rs143383、rs224334和rs224329位点进行单倍型重构，分别获得4和7种单倍型;进而利用χ2检验检验病例组和对照组两个基因不同单倍型的分布，为了避免多重检验所带来的统计学偏倚，采用置换检验(Permutation test)方法对χ2检验P值进行修正，置换次数为10000次。

　　大骨节病病例组和健康对照组之间rs143383位点与rs224334位点检出GT、GC、AC和AT四种单倍型频率，其中单倍型AT χ2检验结果P<0.05，表明单倍型AT可能与大骨节病存在相关性(表5)。为了进一步说明单倍型AT与大骨节病关联的密切程度，计算列联系数r为0.15，说明关联性较弱。表4 rs143383、rs224334和rs224329位点单位点关联分析的结果

　　rs143383、rs224334和rs224329三个位点单倍型重构分析，单倍型TGC和TAT在大骨节病病例组和健康对照组χ2检验存在显著性差异，Permutation检验校正后TGC的P值仍<0.05(表6)。为了进一步说明单倍型TGC和TAT与大骨节病关联的密切程度，计算列联系数r分别为0.21和0.17，说明关联性均较弱。但是，单倍型TGC表现出与大骨节病有比较强的关联性。表5 rs143383位点和rs224334位点单倍型的关联分析表6 rs143383、rs224334位点和rs224329位点单倍型的关联分析

　　3 讨 论

　　大骨节病是骨关节病的一个特殊类型，且发病有个体差异。国外采用全基因扫描的方法发现骨关节病易感基因位于11q、2q和12q[57]。我国郭雄等对大骨节病核心家庭发病特点及流行病学特点进行了调查，发现大骨节病具有明显的家庭聚集性。国内有调查表明，江苏汉族人群中GDF5基因5非翻译区域+104T/C等位基因与膝关节骨性关节炎易感性具有显著相关性[8]。转化生长因子5(GDF5)又称作软骨形态发生蛋白1，是转化生长因子B超家族中的一员，与骨形态发生蛋白亚类密切相关，具有促进人类关节软骨蛋白多糖合成的作用。

　　尽管本调查的GDF5基因3个SNP多态性位点单位点关联分析并未显示与大骨节病有统计学意义的关联性，但单倍型分析显示AT、TGC和TAT这3个单倍型的分布在大骨节病患者和健康人之间存在差异(P<0.05)，其中单倍型TGC经过10000次假设检验后P值仍然<0.05。这些证据显示单倍型AT、TGC和TAT与大骨节病具有相关性，尤其以单倍型TGC最为显著。

　　在实验数据分析中rs223429位点HW检验结果显示病例组HW检验不平衡。然而，其他两个SNP位点不存在这一现象。其原因可能是大骨节病这一疾病本身影响了rs223429位点在人群中的HW平衡，所以推测rs223429位点和大骨节病相关。其次，由于SNP多态性位点的关联性很容易受到不同群体遗传结构的影响，所以也推测可能是本次研究中所选取的样本结构影响了rs223429位点在人群中的HW平衡。由于潜在的群体分层和混合影响样本的代表性，因此建议在后续的研究中应扩大样本量、注重遗传背景单一的样本和SNP标记密度。综上所述，本次调查发现单倍型TGC与大骨节病具有相关性，值得进一步深入研究。

参考文献

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