非洛地平对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用

　　　　 作者：祁杰，盛婴，郑见宝，袁祖贻

【摘要】 目的 研究非洛地平(felodipine)对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活性氧(ROS)及细胞间粘附分子1(ICAM1)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)mRNA表达的影响，探讨其独立于降血压外的抗动脉粥样硬化的作用机制。方法 筛选oxLDL与HUVECs细胞孵育最适的干预浓度梯度与时间，然后与不同浓度的非洛地平(0.1、1、10μmol/L)共同孵育24h，流式细胞仪测定细胞内ROS，real timePCR检测细胞ICAM1、VCAM1mRNA的表达。结果 oxLDL对HUVECs内ROS的产生呈浓度依赖效应，随着刺激浓度的升高，ROS产生增多，25mg/L oxLDL作用最为显著(P<0.01)，非洛地平可抑制oxLDL诱导的HUVECs ROS(P<0.05)的产生;随oxLDL刺激浓度的增加，ICAM1、VCAM1 mRNA表达逐渐上调，当浓度达到25mg/L时，作用最为显著(P<0.05)，非洛地平可下调ICAM1、VCAM1 mRNA的表达(P<0.05)。结论 非洛地平可抑制oxLDL诱导的HUVECs ROS的产生以及下调ICAM1、VCAM1 mRNA表达，发挥抗氧化抗炎的内皮保护功能。

【关键词】 非洛地平;氧化型低密度脂蛋白;氧化应激;动脉粥样硬化;人脐静脉内皮细胞;细胞间粘附分子1;血管细胞粘附分子1

　　ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of felodipine on reactive oxygen species (ROS) generation， mRNA level of inflammatory factors such as intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) and vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1)， in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injured by oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL) so as to explore felodipines antiatherosclerosis mechanism independent of its antihypertensive effect. Methods Isolated HUVECs were treated with oxLDL at different concentrations (6， 12.5 and 25mg/L) for 24 hours so that the optimal concentration and time of oxLDL treatment were selected. Then the cells were incubated with oxLDL and treated with felodipine at different concentrations (0.1， 1 and 10μmol/L). Intracellular ROS level was determined by flow cytometry (FCM). Expressions of inflammatory factors ICAM1 and VCAM1 were measured by real timepolymerase chain reaction (real timePCR). Results ROS generation was increased in HUVECs after treatment with different concentrations (6， 12.5 and 25mg/L) of oxLDL for 24 hours and there was a significant difference at 25mg/L oxLDL (P<0.01); ROS generation was decreased after felodipine treatment for 24 hours (P<0.05). The mRNA expression of ICAM1 and VCAM1 in HUVECs during treatment with 25mg/L oxLDL was significantly higher than that in the control group (P<0.05)， but ICAM1 mRNA and VCAM1 mRNA expressions were significantly downregulated during treatment with 0.1μmol/L felodipine (P<0.05). Conclusion Felodipine has an antiatherosclerosis endothelial protective effect. The antioxidation and antiinflammation mechanism may be related to its inhibiting HUVECs ROS generation induced by oxLDL as well as downregulating ICAM1 and VCAM1mRNA expressions.

　　KEY WORDS: felodipine; oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL); oxidative stress; atherosclerosis; human umbilical vein endothelial cell; intercellular adhesion molecule1 (ICAM1); vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1)

　　动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是一种慢性炎症反应过程[1]。但是，其发病机制目前还不十分清楚。近年来，从信号传导和基因调控水平的研究揭示了氧化应激和炎症是As发生的两个关键成分。这两个看似不相关的独立致病因素却是相互调控，共同存在的。钙通道阻滞剂独立于降压以外的多效作用备受关注，其中抗As作用尤其受到重视。非洛地平(felodipine)是第2代长效1，4二氢吡啶类钙通道阻滞剂，已作为高血压病的首选药物在临床广泛应用。我们前期研究发现非洛地平可减轻高脂饮食喂养的兔主动脉粥样硬化病变[2]。本实验试从细胞水平探讨非洛地平的抗As作用及可能的机制，为临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 M199培养基购自GIBCO公司;胎牛血清购自杭州四季青生物研究所;非洛地平原粉、溶剂二甲亚砜(DMSO)、2，7二氯荧光素二乙酸脂(DCFHDA)购自Sigma公司;总RNA提取试剂(Trizol)购自Invitrogen公司;逆转录聚合酶链反应试剂盒为美国Promega公司产品;兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物公司;DNA荧光染料(SYBR GreenⅡ)购自TaKaRa公司;引物由上海生物工程有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　本实验选用原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVECs)，标本来自于西安交通大学医学院第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带放入无菌容器中，3h内行脐静脉内皮细胞的分离培养。置于50mL/L CO2、37℃培养箱中孵育，待原代培养细胞生长至80%～90%融合后进行传代培养。将原代和传至第3代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，待细胞均匀铺满孔底吸出培养液，用PBS冲洗盖玻片，冷风吹干后-20℃低温冰箱中冻存，用于Ⅷ因子相关抗原的检测。第4代细胞用于实验。

　　氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein， oxLDL)的制备：采用一次性密度梯度超速离心法分离LDL。新鲜健康人血浆购自血库。血浆在密度为1.063和1.020的密度梯度液中，于4℃、50000r/min离心5h。分离出的LDL在4℃的LDL透析液中透析36h，用0.45μm微孔滤膜除菌保存。将已氧化的LDL在无EDTA的PBS中4℃透析36h，然后加入含CuSO4 PBS液，37℃氧化18h。再置于PBS液中透析24h。于4℃避光保存，备用。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定LDL和oxLDL的纯度。用硫代巴比妥酸反应法测定LDL和oxLDL的丙二醛含量以确定其氧化修饰程度。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 取第3代HUVECs于37℃、50mL/L CO2培养箱孵育，然后传代、消化，接种在6孔培养板中，观察细胞生长融合约80%后，换成含100mL/L胎牛血清的培养液继续培养24h，应用不同浓度的oxLDL孵育3代细胞，同时加用不同浓度的非洛地平进行干预，孵育24h。实验分组：①空白组：M199培养基与100mL/L胎牛血清;②oxLDL组(As模型)：分别加入oxLDL 6、12.5、25mg/L孵育24h;③非洛地平组：0.1、1、10μmol/L非洛地平分别与25mg/L oxLDL孵育24h;④溶剂对照组：DMSO。

　　1.2.2 内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的检测 采用免疫荧光染色。取出冻存的盖玻片，加入40g/L多聚甲醛固定30min，PBS冲洗，滴加1∶10兔抗人Ⅷ因子抗体血清，再滴加1∶100荧光素标记的羊抗兔免疫荧光抗体，同时设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍照。

　　1.2.3 细胞活性氧(reactive oxygen species， ROS)的测定 ①按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFHDA;②去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFHDA 1mL;③37℃细胞培养箱内孵育20min;④流式细胞仪检测细胞荧光强度，以CELL QuestTM软件分析平均荧光强度。

　　1.2.4 实时荧光定量PCR检测细胞间粘附分子1(ICAM1)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)mRNA的表达 ①RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明书提取RNA，所用器皿均用1g/L DEPC水处理，以防止RNA酶污染;②逆转录合成cDNA：按照Promega逆转录聚合酶链反应试剂盒说明书在PCR仪上进行逆转录合成cDNA;③引物的设计与合成：扩增引物序列为：GAPDH正义引物5′CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAG3′，反义引物5′GTGGAATCATATTGGAACATGTAG3′;ICAM1正义引物5′CCGGAAGGTGTATGAACGT3′，反义引物5′TCCATGGTGATCTCTCCTC3′;VCAM1正义引物5′GGGACCACATCTACGCTGACAA3′，反义引物5′GGCCACTCAAATGAATCTCTGGA3′;④实时荧光定量PCR扩增目的基因ICAM1、VCAM1：20μL反应体系在荧光定量PCR仪上进行，反应条件为95℃ 5min，58.5℃ 15min，72℃ 10min，扩增40个循环，反应结束后，系统以采集到的每一循环反应时各反应管的荧光强度增长指数进行分析。

　　1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS 13.0统计软件分析处理，计量资料数据以±s表示。组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。实时荧光定量PCR的数据采用比较阈值法分析处理。

　　2 结 果

　　2.1 培养的HUVECs形态学观察 细胞接种24h后，倒置显微镜下，培养细胞为单层，呈铺路石状镶嵌排列。细胞为扁平多角形，边界清楚，胞质丰富。细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁1～2个(图1)。传代细胞较原代生长旺盛，可见多个双核及核分裂细胞，有时可见多核及巨细胞。

　　图1 高倍镜下人脐静脉内皮细胞的形态

　　Fig.1 Morphous of HUVECs under highpower lens (×200)

　　2.2 原代及传代血管内皮细胞中Ⅷ因子相关抗原 荧光显微镜下可见培养的HUVECs胞质内有黄绿色荧光，证实人Ⅷ因子相关因子的存在(图2)。

　　2.3 不同处理组细胞内ROS的产生 采用流式细胞仪测定不同处理组细胞内ROS的产生(图3)。结

　　图2 荧光显微镜下人脐静脉内皮细胞胞质Ⅷ因子的表达

　　Fig.2 Expression of Ⅷ factor of HUVECs under fluorescence microscope (×200)

　　果显示：oxLDL对HUVECs内ROS产生呈浓度依赖效应，随着刺激浓度的升高，ROS产生增多;当25mg/L oxLDL作用24h后，细胞内ROS产生明显增加(P<0.01)。溶剂对照组细胞内ROS含量无明显改变(P>0.05，图4A)。非洛地平与oxLDL共孵育24h后，各浓度组均可抑制ROS的产生，以0.1μmol/L作用最为显著(P<0.01，图4B)。

　　2.4 oxLDL及非洛地平对HUVECs的ICAM1，VCAM1 mRNA表达的影响 随oxLDL浓度的增加，ICAM1、VCAM1 mRNA表达逐渐上调，呈浓度依赖性;当浓度达到25mg/L时，作用最为显著，分别为对照组的(2.24±0.25)、(2.69±0.38)倍(P<0.05，表1)。不同浓度的非洛地平均可抑制25mg/L oxLDL刺激下HUVECs ICAM1、VCAM1 mRNA的表达，且以低浓度作用显著，分别为对照组的(0.46±0.12)、(0.38±0.13)倍(P<0.05，表2)。表1 不同浓度oxLDL作用下ICAM1、VCAM1 mRNA的表达数据以2-△△CT表示。*P<0.05，与溶剂对照组比较。表2 非洛地平对HUVECs的ICAM1、VCAM1 mRNA表达的影响

　　3 讨 论

　　在As和急性冠状动脉综合征有关的心血管功能障碍的发生和发展中，氧化应激起主要作用。研究表明，细胞内产生ROS的氧化还原反应是细胞内调节信号转导的重要化学过程之一，而且产生的ROS是心血管疾病中重要的危险因子之一，参与包括细胞炎症在内的多种病理过程。在病理条件下或衰老时ROS的增加超过细胞初级抗氧化防御能力时，可引起脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，最后导致细胞死亡或凋亡，引起组织损伤及疾病发生。这是体内氧化和抗氧化失去平衡的结果[3]。oxLDL可增强释放ROS引发氧化应激效应加速As病理生理过程[4]。本实验发现低浓度的oxLDL可使HUVECs内ROS产生增加，且呈浓度依赖性，而正常对照组内的ROS呈低水平。以往文献报道高浓度的oxLDL(50、100、200mg/L)可增加ROS的生成。本实验发现采用低浓度oxLDL(6、12.5、25mg/L)作用HUVECs，同样可使ROS产生增加，损伤内皮;而同时加用非洛地平后可明显抑制ROS产生，且以低浓度作用显著。表明降低细胞内钙离子浓度可减少ROS的产生，减轻细胞损伤。提示细胞内Ca2+负荷与ROS的产生有关。

　　As病变发生发展直至最终血栓形成的各个阶段，炎性反应起着重要的作用。目前，在As发病中研究较多的主要有ICAM1和VCAM1。研究表明，oxLDL能够诱导血管内皮细胞和白细胞上调ICAM1的表达，介导单核细胞与血管内皮细胞的粘附[56]。王斌等[7]研究表明，oxLDL可损害内皮细胞的功能，增加内皮细胞ICAM1的表达。有大量证据表明，黏附分子所介导的炎性反应参与As及心肌梗死的病理过程[8]。在As形成早期，VCAM1主要表达于内皮细胞。大多数研究表明，oxLDL可诱导VCAM1在内皮细胞上表达。近年来，人们对ICAM1、VCAM1在As中表达上调的分子机制进行了深入探讨，认为ROS作为中介，激活核转录因子NFκB，加强ICAM1、VCAM1的转录[9]。ROS和促炎症细胞因子间通过NFκB形成恶性循环，不断地促使促炎症因子和炎症蛋白基因表达，引起炎症反应[10]，并以恶性循环的形式使炎症反应不断放大和持续存在。本实验观察到不同浓度oxLDL刺激后可上调炎症分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达，并呈浓度依赖性。结合ROS的实验结果，推测致炎因子oxLDL可能通过ROS激活NFκB而使ICAM1、VCAM1 mRNA表达上调。大量基础实验研究及临床试验证实多数钙通道阻滞剂具有抗As作用，目前认为其可能的机制为[1113]：①抗氧化作用;②抑制单核内皮细胞相互作用;③减轻炎症反应。有报道指出阿折地平可以减少球囊诱发血管损伤模型中TNFα、MCP1在平滑肌细胞中的表达[14];TAN等[15]研究发现非洛地平通过NFκB途径减轻代谢综合征模型小鼠的血管炎症;NAKANO等[16]研究发现阿折地平具有不依赖降低血压机制的抗As作用;YAO等[17]发现非洛地平对高脂饮食载脂蛋白E基因敲除小鼠有抗As作用。本实验发现非洛地平可显著下调ICAM1、VCAM1 mRNA表达，具有独立于降压作用以外抑制炎症的细胞保护作用，推测可能与其降低细胞ROS产生，抑制NFκB的激活作用有关。

　　综上，通过本研究发现非洛地平具有抗As的内皮细胞保护功能，可能是通过减轻oxLDL诱导的HUVECs的钙负荷，从而减少ROS及炎症介质的产生。这一机制的阐明将有利于确立钙通道阻滞剂在As发生发展中的地位，并为临床应用提供新的理论依据。

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