自发性高血压大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道的活性及表达改变

　　　　 作者：胡志，马爱群，田红燕，席雨涛，范力宏，王亭忠

【摘要】 目的 观察自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats， SHR)与WistarKyoto(WKY)大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)大电导钙激活钾通道(large conductance calciumactivated potassium channel， BKCa)电流及通道α亚单位表达的差异。方法 实验采用16～18周龄SHR(N=20)及WKY(N=20)大鼠，尾套法测量大鼠尾动脉血压;胶原酶分离VSMCs，全细胞膜片钳技术记录全细胞总钾电流密度及BKCa电流;激光共聚焦观察BKCaα亚单位在VSMCs胞膜及胞质内的分布。结果 SHR较WKY大鼠的收缩压与舒张压均有显著升高(P<0.05);全细胞外向钾电流密度及BKCa电流密度均有显著性增加(P<0.05);SHR的BKCaα亚单位在胞膜及胞质内均有广泛分布，SHR大鼠VSMCs胞质与胞膜的荧光强度较WKY大鼠均有显著性升高(P<0.05)。结论 BKCa电流密度增加可能与BKCa通道α亚单位的表达增多有关，SHR大鼠VSMCs的BKCa电流密度增加引起血管的舒张，不能抵消平滑肌细胞的肌源性收缩可能是导致高血压的发生机制之一。

【关键词】 高血压;膜片钳;大电导钙激活钾通道;血管平滑肌细胞

　　Diseases of Ministry of Education， Xian 710061， China)ABSTRACT: Objective To observe the differences in large conductance calciumactivated potassium (BKCa) current and expression of BKCa channel α subunits in vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from mesenteric arteries between spontaneous hypertensive rats (SHRs) and WistarKyoto (WKY) rats. Methods Tail cuff blood pressure of rats was measured in 20 SHRs and 20 WKY rats aged 16-18 weeks. The VSMCs were isolated using collagenase. The total outward potassium current and BKCa current were observed using the whole cell patch clamp. The expression of BKCa α subunits of VSMCs was observed using confocal imaging. Results Both systolic blood pressure and diastolic blood pressure of SHRs increased significantly compared with those of WKY rats (P<0.05). The whole cell outward potassium current density and BKCa current density of VSMCs from SHRs were significantly larger than those of WKY rats (P<0.05). BKCa α subunits were distributed not only uniformly along the plasmalemmas but also extensively in cytoplasmic regions; the average pixel intensity of BKCa α subunit in cytoplasm and plasmalemmas was highly increased in SHRs compared with that in WKY rats (P<0.05). Conclusion The increased BKCa current density of VSMCs from SHRs may be related to the high expression of BKCaα subunits. The VSMCs relaxation caused by increased BKCa current density cannot counteract myogenic tone of artery， which contributes to genesis and development of chronic hypertension.

　　KEY WORDS: hypertension; patch clamp; large conductance calciumactivated potassium channel; vascular smooth muscle cell

　　高血压是严重危害人类健康的疾病。目前认为，小动脉及阻力血管的肌源性张力是血管外周阻力及血压形成的重要因素。目前，在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)已确认至少存在4种钾通道：钙激活钾通道、ATP敏感性钾通道、电压依赖性钾通道及内向整流钾通道。它们通过调节VSMCs的膜电势(membrane equilibrium potential， Em)影响动脉的张力及直径，同时又是许多血管活性物质的作用靶点[1]。大电导钙激活钾通道(large conductance calciumactivated potassium channel， BKCa)是VSMCs运载外向电流的优势通道，对于调节VSMCs舒缩和负反馈调节小动脉肌源性紧张等方面有着重要意义。研究表明自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats， SHRs)动脉血压水平与主动脉VSMCs的BKCa电流密度呈显著正相关，高血压的缓解使BKCa电流密度下降[1]，BKCa对胞内Ca2+敏感度增加可能是卒中倾向SHR及用左旋硝基精氨酸甲酯诱导出高血压的WistarKyoto(WKY)大鼠脑基底动脉BKCa电流密度增加的机制[2]。我们推测，高血压状态时阻力血管肠系膜动脉VSMCs的BKCa通道可能也存在表达及电流特性的改变，这对于阐明高血压的发病机制和寻找新的抗高血压靶点药物具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物和试剂 实验采用16～18周龄的SHR(n=20)与WKY大鼠(n=20)，雌雄不限，均购自西安交通大学医学院实验动物中心。牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)、四乙基胺(tetraethylammonium， TEA)、木瓜蛋白酶(papain)、二巯基苏糖醇(dithiothreitol， DTT)、MgATP、4羟乙基哌嗪乙磺酸[4(2hydroxyerhyl)piperazine1erhanesulfonic acid，HEPES]均购自Sigma公司;兔抗BKCaα亚单位购自Alomone Labs公司;羊抗兔IgGFITC由华美生物工程公司提供;其余试剂均为国产分析纯。

　　1.1.2 溶液 生理盐溶液(physiological salt solution， PSS)成分(mmol/L)：NaCl 127，KCl 5.9，MgCl2 1.2，CaCl2 2.4，HEPES 10，dextrose 12，NaOH调节pH值为7.3～7.4。无钙PSS液：除不含CaCl2外，其余成分同PSS。细胞外液同PSS，记录BKCa电流时应用含1mmol/L的TEA溶液，其余成分同PSS。电极内液(mmol/L)：KCl 130，MgCl2 1.0，MgATP 5，EGTA 0.5，HEPES 10，KOH调节pH值为7.3～7.4。酶分离液：2.5mg BSA，8mg papain，4mg DTT 溶入2mL无钙PSS。除电极内液，所有溶液使用前均通以100% O2后备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血压的测量及肠系膜动脉上动脉平滑肌细胞的分离 血压测量系统(ABI， USA)检测大鼠清醒安静状态下的尾动脉血压，每只大鼠均测量3次取其平均值。乙醚麻醉大鼠后断头处死，迅速取出肠系膜动脉上动脉支配的全段肠系膜置于4℃ PSS中，解剖显微镜下仔细剔去肠系膜动脉血管壁上的脂肪和纤维组织。将血管转移至2mL的无钙PSS中剪成碎块，室温下静置20～25min后转移至2mL酶分离液中，37℃温浴消化20min，吹打分离VSMCs并置于4℃冰箱保存备用。

　　1.2.2 全细胞膜片钳实验 实验采用全细胞膜片钳模式。记录电极用内径1.5mm玻璃毛细管(BJ40，北京正天易科贸有限公司)经电极拉制仪(PP830， NARISHIGE， Japan)两步拉制，抛光仪(MF830，NARISHIGE， Japan)抛光处理，电极阻抗为3～5MΩ，封接阻抗达1G以上补偿快电容，施以负压使细胞破膜形成全细胞模式。运行PCLAMP软件(PCLAMP 6.0.4， Axon Instruments， USA)的膜测试功能记录细胞膜电容(Cm)(电压钳模式，滤波5kHz，保持电位-60mV，除极化至-65mV)。保存膜测试结果，随后以放大器(Axopatch 200B， Axon Instruments， USA)的慢电容补偿和串联电阻补偿(50%～80%)减少瞬时充放电电流和钳位误差，信号采集频率5kHz，低通滤波频率2kHz。为消除细胞间误差，电流均以电流密度(pA/pF)表示，细胞外灌流用恒流泵(HL2，上海沪西分析仪器厂)控制流速。首先记录全细胞钾电流，将细胞外液换入含有1mmol/L的TEA溶液，由于TEA在低浓度(≤1mmol/L)时具有阻断BKCa通道的效应[3]。所以，换液后10min时重复记录减少的外向钾电流即为BKCa电流。

　　1.2.3 刺激方式的设定 脉冲刺激方式记录全细胞电流，钳制电位-60mV，由-50mV除极到+70mV，阶跃10mV，刺激间隔5s，脉冲时程400ms。

　　1.2.4 激光共聚焦观察VSMCs上BKCaα亚单位的表达及免疫荧光强度分析 VSMCs贴壁后以40g/L多聚甲醛固定30min;加入1mL/L的Triton X100室温静置30min;100mL/L山羊血清4℃过夜;加入兔抗大鼠BKCaα亚单位抗体(一抗，1∶100)，4℃孵育过夜;加入羊抗兔IgGFITC(二抗，1∶100)，37℃孵育40min。上述各步骤间均用0.01mmol/L的PBS洗涤10min×3次。碳酸盐甘油缓冲液封片。同时以PBS代替一抗作为空白对照。激光共聚焦显微镜(BioRad MRC1024，USA)于激发波长488nm观察BKCaα亚单位的分布和表达。采用Leica成像分析系统进行免疫荧光定量分析，结果以平均像素强度表示。

　　1.2.5 统计学处理 所有结果以±s表示，数据用Clampfit 9.2和SPSS11.0统计软件处理。组间资料具有可比性，成组资料的比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 SHR与WKY大鼠血压的比较 成年SHR平均收缩压为(184.6±8.7)mmHg，较WKY大鼠平均收缩压(120.3±9.3)mmHg有显著性升高(P<0.01)。此外，SHR平均舒张压为(123.4±15.4)mmHg，较WKY大鼠平均舒张压(93.0±10.0)mmHg也有显著性升高(P<0.01)。

　　2.2 SHR与WKY大鼠VSMCs的BKCa电流及Ⅰ～Ⅴ曲线特征的比较 新分离的大鼠VSMCs呈梭形，胞核清晰，胞质内均匀无颗粒。SHR与WKY大鼠肠系膜动脉VSMCs的直径及长度均无差异。图1A、B显示SHR与WKY大鼠VSMCs全细胞外向钾电流在　A、B：1mmol/L TEA对SHR与WKY大鼠肠系膜动脉VSMC的全细胞钾电流的影响;C、D：1mmol/L TEA对VSMCs的Ⅰ～Ⅴ曲线的影响，不同电压点TEA灌注前后电流密度的差值为BKCa电流。*P<0.05，与对照组比较，1mmol/L TEA灌注后平均外向钾电流显著减少;P<0.05，与WKY大鼠比较，SHR VSMCs的BKCa电流显著增高。加入1mmol/L TEA后外向钾电流幅度降低。SHR大鼠VSMCs(n=14)平均外向钾电流密度显著高于WKY(n=16)(图1C，D);刺激电压0mV时，平均外向钾电流为SHR(6.4±3.6)pA/pF vs. WKY(2.1±1.2)pA/pF(P<0.05);刺激电压70mV时，平均外向钾电流为SHR(41.7±1.5)pA/pF vs. WKY(30.2±3.8)pA/pF(P<0.05)。加入1mmol/L TEA灌注10min后，SHR与WKY大鼠VSMCs总外向钾电流密度均有显著减小(P<0.05)。减少部分表示BKCa电流在总外向钾电流中所占的比例，SHR较WKY的降低程度更高(0mV：SHR 4.2pA/pF vs. WKY 1.5pA/pF，P<0.05;70mV：SHR 20.6pA/pF vs. WKY 8.2pA/pF，P<0.05，图1C，D)。刺激电压70mV时，SHR肠系膜动脉VSMCs的平均BKCa电流密度是WKY大鼠的2.5倍。

　　2.3 SHR与WKY大鼠肠系膜动脉VSMCs的BKCaα亚单位的表达差异 WKY大鼠肠系膜动脉VSMCs的BKCaα亚单位均匀分布在细胞膜上(图2A)，胞质内少量分布。SHR肠系膜动脉VSMCs的BKCaα亚单位在胞膜和胞质内均有大量分布(图2B)。未加一抗的平行对照组未观察到荧光(图2C，D)。免疫荧光强度分析显示，SHR肠系膜动脉VSMCs(n=14)胞质与胞膜的荧光强度分别是WKY大鼠(n=14)的(2.1±0.42)倍(P<0.05)和(1.5±0.28)倍(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　高血压时VSMCs肌源性张力增高与其去极化状态有关[4]，作为阻力血管的肠系膜动脉，其VSMCs静息Em改变与高血压的发生更具有相关性。BKCa通道是VSMCs运载外向电流的优势通道，由α功能亚单位和β调节亚单位组成，在调节血管平滑肌舒缩和负反馈调节小动脉肌源性紧张等方面有着重要作用。高血压时VSMCs的BKCa通道功能增强可能是血压升高时负反馈抑制血管张力，阻止血压升高的保护机制[5]。

　　研究表明，SHR主动脉[6]、颈动脉[7]、脑血管[5]及下肢动脉[8]都存在BKCa通道的活性增强。刺激电压为0mV时，SHR脑动脉VSMCs的BKCa通道平均峰电流密度是WKY大鼠的4.7倍[5]。本研究对肠系膜动脉VSMCs的研究显示，刺激电压为70mV时，SHR的BKCa电流密度是WKY大鼠的2.5倍。有人认为SHR的BKCa通道活性增强是由于电压依赖性Ca2+通道导致的细胞内Ca2+浓度升高所致[8]。我们的研究表明，BKCa通道活性增强同时伴随VSMCs胞膜BKCa通道α亚单位的表达增强。但是，对临界性和严重高血压大鼠模型的脑动脉、肺动脉高压模型肺动脉的研究表明，BKCa通道活性降低，β1亚单位的表达降低。这可能与高血压模型和BKCa通道的组织特异性有关。

　　免疫荧光染色发现牛冠状动脉VSMCs的BKCaα亚单位在胞质和胞膜中的分布并无差异[9]。F344大鼠冠状动脉VSMCs的BKCaα亚单位主要分布在胞膜上，而胞质中分布很少[10]。本研究发现，WKY大鼠BKCaα亚单位主要分布在VSMCs胞膜上，SHR的胞质和胞膜上均有大量分布。提示SHR肠系膜动脉VSMCs的BKCaα亚单位在胞内有大量合成和表达。SHR肠系膜动脉VSMCs胞膜BKCaα亚单位的大量表达，表明SHR肠系膜动脉VSMCs的BKCa电流密度增加可能与BKCaα亚单位表达及合成增强有关。

　　总之，SHR VSMCs的BKCa电流密度增加可能与BKCa通道α亚单位的表达增多有关，SHR VSMCs的BKCa电流密度增加引起血管的舒张，不能抵消平滑肌细胞的肌源性收缩可能是导致高血压的发生机制之一。

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　　[8]ASANO M， MASUZAWAITO K， MATSUDA T. Charybdotoxinsensitive K+ channels regulate the myogenic tone in the resting state of arteries from spontaneously hypertensive rats [J]. Br J Pharmacol， 1993， 108(1):214222.

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　　[10]MARIJIC J， LI Q， SONG M， et al. Decreased expression of voltage and Ca2+activated K+ channels in coronary smooth muscle during aging [J]. Circ Res， 2001， 88(2):210216.(编辑 邱 芬)