肠易激综合征模型大鼠血清酪酪肽水平及其受体特性的测定

　　　　 作者：刘欣，潘淑波，龚均，董蕾，王景林

【摘要】 目的 通过测定肠易激综合征(IBS)大鼠血清酪酪肽(PYY)水平及其空肠黏膜上皮细胞PYY受体的变化，探讨IBS的发病机制。方法 将SD大鼠随机分成IBS腹泻型组(DIBS组)、IBS便秘型组(CIBS组)及对照组，应用同位素放射免疫法测定各组PYY水平及反映受体特性的两个参数：平衡解离常数(Kd)和最大结合容量值(Bmax)。结果 ①DIBS组血清PYY水平为(66.50±32.10)pg/mL，与正常对照组的(15.33±10.63)pg/mL比较，差异有统计学意义(P<0.001);CIBS组血清PYY水平为(19.51±17.62)pg/mL，与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。②DIBS组Kd=203.29±77.14，Bmax=645.71±184.30;CIBS组Kd=347.43±162.76，Bmax=671.86±162.96，与正常组(Kd=328.75±92.11，Bmax=880.00±410.70)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 IBS可能与血清PYY水平的高低有关而与其受体的变化无关。

【关键词】 肠易激综合征，胃肠激素，酪酪肽，酪酪肽受体

ABSTRACT: Objective To explore the mechanism of irritable bowel syndrome by determining the serum level of peptide (PYY) in rats with (IBS) and changes of PYY receptors in jejunm epithelial cells in IBS rats. Methods SD rats were randomly pided into DIBS group， CIBS group and control group. We employed radioimmunoassay (RIA) method to measure the serum level of PYY in each group as well as the dissociation constant (Kd) and maximum binding capacity (Bmax)， the two basic parameters reflecting the characteristics of PYY receptor. Results The serum level of PYY in DIBS group (66.50±32.10)pg/mL was significantly higher than that in normal group (P<0.001)， but the serum level of PYY in CIBS group (19.51±17.62)pg/mL did not significantly differ from that in normal group (P>0.05). Kd and Bmax values in DIBS group (Kd=203.29±77.14， Bmax=645.71±184.30) and CIBS group (Kd=347.43±162.76， Bmax=671.86±162.96) were not significantly different from those in normal group (Kd=328.75±92.11， Bmax=880.00±410.70) (P>0.05). Conclusion IBS may be related to the changes of the serum level of PYY， but not to the changes of PYY receptor.

　　KEY WORDS: irritable bowel syndrome; gut hormone; peptide YY; peptide YY receptor

　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome， IBS)指的是一组包括腹痛、腹胀、排便习惯改变和大便性状异常等表现的临床综合征，持续存在或反复发作，经检查排除引起这些症状的器质性疾病。罗马Ⅲ标准[1]主要依据粪便性状将IBS分为IBS合并便秘(CIBS)、IBS合并腹泻(DIBS)、混合型IBS(MIBS)和未分型IBS(UIBS)4种亚型。IBS是一种最常见的功能性肠道疾病，且发病率有逐年上升的趋势。其病因和发病机制尚未清楚，认为可能与精神心理因素、内脏高敏感性、胃肠动力学异常、免疫异常、感染等多方面的因素有关。酪酪肽(peptide YY， PYY)是近年发现的一种新的胃肠激素，其对于消化道的生理功能有多种重要的调节作用，包括抑制胃肠蠕动[2]及肠黏膜分泌[3]、抑制胆囊收缩[4]、刺激肠上皮增生[5]、抑制胰腺外分泌[6]等。本课题通过测定IBS大鼠的血清PYY水平及其空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的平衡解离常数(dissociation constant， Kd)和最大结合容量值(maximum binding capacity， Bmax)，观察IBS大鼠的PYY水平及其受体变化与疾病之间的关系，从而进一步探讨IBS的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重200～280g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 主要仪器、药品与试剂 紫外分光光度计UV260 SHIMADZU(日本);FM200010γ免疫计数器(西安凯普机电有限责任公司);PYY放免试剂盒、 PYY、125IPYY比活度2200Ci/mmol(SIGMA)公司;考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.3 实验动物的分组 按照随机分配的原则，将实验动物分成3组，即DIBS组、CIBS组以及对照组，每组10只。

　　1.4 模型制备 ①DIBS大鼠模型[7]：实验前12h禁食，实验第1天给大鼠称重，乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管(距肛门8cm)，结肠内灌入40mL/L的乙酸1mL。缓慢拔出硅胶管，用手压迫肛门并将大鼠尾巴抬高30s，然后用生理盐水冲洗结肠。恢复6d。实验第7天行束缚应激3h。②CIBS大鼠模型[8]：给予冰水2mL灌胃2周，共14d，观察大便性状改变。③对照组：置于安静环境中喂养，自由饮水、摄食。④IBS的分型判定标准：各组造模结束后，DIBS组收集应激期3h内的大鼠粪便，观察各组大鼠粪便性状，若粪粒数、粪便湿重和粪便含水量较对照组增多且有统计学差异，表明DIBS造模成功;CIBS组收集12h内的大鼠粪便，若粪粒数、粪便湿重和粪便含水量较正常组减少且有统计学差异，表明CIBS造模成功。⑤IBS大鼠模型组及正常对照组内脏敏感性的检测：进行完以上实验后，这3组大鼠分别在乙醚麻醉下，把Braun8F导尿管外涂石蜡油后经肛门插入，大鼠放入鼠固定器内，限制大鼠的各项活动，但可以观察到其腹部收缩反射。用胶带将导尿管平肛门外缘水平固定于鼠尾，待大鼠清醒15min后，在安静状态下经导尿管外口向球囊内注入常温水(26～28℃的生理盐水)，记录引起大鼠腹部收缩反射的最小注水量为最小容量阈值。重复扩张3次，每次间隔15min，以3次扩张测得的最小容量阈值的均值为直肠扩张引起腹部收缩反射的最小容量阈值(TVAC)。测定阈值后休息30min，分别测定注水量为0.8、1.2、1.6mL时3min内大鼠腹部收缩反射的次数，每次间隔15min，用引起大鼠腹部收缩反射的最小容量阈值和直肠内球囊不同容量扩张时3min内大鼠腹部收缩反射的次数，评价大鼠对直肠内扩张刺激的敏感性。

　　1.5 血清PYY激素水平的测定 各组大鼠处死前分别采其腹主动脉血，离心后获得血清，用同位素放射免疫法检测各组大鼠血清中的PYY激素水平。

　　1.6 大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的测定 ①参照文献[910]制备大鼠空肠黏膜上皮细胞膜标本;②考马斯亮蓝法测定大鼠空肠黏膜上皮细胞的膜蛋白浓度;③受体放射配基结合分析方法测定大鼠空肠黏膜PYY受体[11]。将得到的PYY受体特异结合数值换算成特异结合百分率[specific binding(%)]做纵坐标，以非标记配体浓度的对数值(LogM)做横坐标，应用Excel制图软件得到竞争抑制曲线，应用公式计算平衡解离常数及最大结合容量值。

　　1.7 统计学分析 采用SPSS13.0软件处理数据。实验结果以±s表示，多组间比较用方差分析，两两比较用LSDt检验。检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 IBS模型可靠性的判定 ①IBS模型组与对照组排便情况的比较。DIBS组在束缚应激期内粪便呈软便或糊状便，粪便颗粒数、粪便湿重及粪便含水量均明显大于对照组(P<0.05，表1);CIBS组在大便收集期内粪便呈颗粒状，粪便颗粒数、粪便湿重及粪便含水量均明显小于对照组(P<0.05，表1)。②各组直肠扩张试验结果见表2。表1 IBS模型组与对照组排便情况的比较表2 直肠扩张腹壁收缩阈值及不同容量扩张时腹壁收缩次数的比较与对照组比较，*P<0.05;与CIBS组比较，#P<0.05 。

　　2.2 各组血清PYY水平及Kd值和Bmax值 ①DIBS组血清PYY水平明显高于正常对照组(P<0.05);②CIBS组血清PYY水平与对照组比较无明显变化(P>0.05);③DIBS组大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的Kd值及Bmax值，与对照组和CIBS组比较均无统计学差异(P>0.05，表3)。表3 各组大鼠血清PYY水平及Kd值和Bmax值的变化

　　3 讨 论

　　IBS是最常见的消化系疾病之一。该病总患病率在5%～25%之间，发达国家约15%，我国约5%左右[1213]。目前普遍认为，IBS的病因是多因素相互作用的结果，发病机制复杂。随着饮食结构的变化，我国该病的发病率也在逐年上升。目前很多学者就IBS与胃肠激素之间的关系做了多方面的研究。

　　胃肠激素是由存在于胃肠道黏膜内的数十种内分泌细胞分泌的，主要化学成分为多肽，它既可作为循环激素起作用，也可作为旁分泌物在局部起作用或者分泌入肠腔发挥作用。大量研究表明，IBS的发病与胃肠激素水平的异常密不可分。梁荣新等[14]曾对IBS 腹泻型及便秘型患者做过研究，发现IBS 腹泻型患者空腹血浆胃动素(MOT)水平显著高于IBS便秘型和正常对照组，而便秘型IBS患者MOT水平低于正常对照组。由此可见，IBS患者MOT 水平增高可能是其产生腹泻的一个因素。血浆中胆囊收缩素(CCK)水平的增加可以增强胃肠运动从而加重胃肠过敏性使得IBS患者出现腹痛等症状[15]。有研究发现，IBS便秘型患者血浆和肠黏膜中血管活性肠肽(VIP)含量明显升高，可能由于VIP对胃肠道运动的抑制作用所致[16]。从上述中可以看出，胃肠激素水平的异常在IBS的发病中起着重要的作用。

　　PYY作为近年发现的一种新的胃肠激素，其对胃肠道有多种复杂的生理功能，与许多胃肠疾病之间存在着不可分割的联系。PYY主要由分布于回肠及结肠黏膜的内分泌细胞即L细胞分泌，为36个氨基酸组成的肽类物质[17]。大量研究表明，PYY与多种胃肠道疾病有关。ADRIAN等[18]测量了结肠癌组织、结肠息肉及正常结肠黏膜的PYY浓度，发现PYY浓度在管状息肉中最高，绒毛状息肉中其次，癌组织中最低，而这个顺序与细胞分化良恶程度是一致的，这说明PYY可能参与了结肠腺瘤样息肉转变为结肠癌的过程。VAN DER [19]测定IBS患者血中的PYY水平，结果发现，肠道敏感性高的患者其餐后PYY水平要明显高于肠道敏感性正常的患者，说明IBS患者血中PYY水平与肠道敏感性有关。本研究结果表明，DIBS组血清PYY水平较正常组明显升高，CIBS组血清PYY水平与正常组比较无明显差异，推测血中PYY水平的变化可能与IBS腹泻症状的产生有关。PYY作为胃肠道的一种抑制性激素，不仅抑制胃肠道的蠕动，而且可以抑制胃酸肠液的分泌，考虑DIBS时PYY水平的升高可能是机体对抗腹泻的一种保护性作用。但是正如上所述，许多胃肠激素的释放都有神经的协同作用，而且胃肠激素本身对胃肠道的调节作用也极其复杂，因此是否由于其他胃肠激素水平的变化间接导致PYY水平的变化，还是由于IBS这个始动因素直接导致PYY水平的变化还未可知，需要进一步的研究。本实验中CIBS组血清PYY水平与正常组比较无明显差异，具体机制有待于进一步研究。考虑与以下因素有关，CIBS组的TVAC虽明显高于对照组，但不同容量扩张时，CIBS组大鼠腹壁收缩次数与对照组比较虽有下降但却无统计学差异，因此不能确定CIBS时内脏敏感性与对照组比较有无差异。而有文献报道血清PYY的水平与肠道敏感性有关[19]。

　　胃肠激素对靶器官的作用不仅取决于激素水平的高低，而且还与受体的特性有关。代表受体亲和力的量化指标是平衡解离常数Kd值，Kd值与受体亲和力呈反向关系。受体的另一重要特征是受体的分布密度，其量化指标是最大结合容量Bmax值，Bmax值与受体的分布密度呈正向关系。早在1986年，MARC等[20]便通过放免实验证明PYY与大鼠空肠黏膜上皮细胞膜受体有较高的结合力，同时对大鼠的多个胃肠脏器，包括胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠以及肝脏等进行PYY与其受体的特异结合实验，结果发现125IPYY在空肠与其受体的特异结合率最高。本研究通过测定各组大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的Kd值和Bmax值，结果表明无论是DIBS还是CIBS，其Kd值和Bmax值与正常组比较均无统计学差异。由此推测IBS可能与血中PYY水平的高低有关而与其受体的变化无关。

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