肥胖抑制素对大鼠心室肌细胞收缩及L型钙通道的影响

　　　　 作者：孙强，胡浩，周筠，于小江，臧伟进，陈晨

【摘要】 目的 探讨肥胖抑制素(obestatin)对心肌细胞收缩、细胞内钙瞬变及细胞膜L型钙通道的影响。方法 采用单细胞收缩/荧光边缘探测系统及全细胞膜片钳技术观察obestatin对急性酶解分离大鼠心室肌细胞收缩及钙信号的影响。结果 10-7mol/L obestatin增强大鼠心室肌细胞收缩幅度[(26.43±6.13)%]及细胞内钙瞬变幅度[(21.33±4.73%)]，并增强ICaL峰值。结论 Obestatin开放心肌细胞膜上L型钙通道，促进钙内流，增强大鼠心室肌细胞ICaL及细胞内钙瞬变，进而增强大鼠心肌细胞收缩。

【关键词】 obestatin;心室肌细胞;钙瞬变;L型钙电流

　　ABSTRACT: Objective To study the effects of obestatin on the contraction， calcium transient and Ltype Ca2+ current (ICaL) in rat ventricular myocytes. Methods The extent of contraction and Ca2+ transient changes were recorded with the motion edge detection system， and Ltype Ca2+ current was recorded with the whole cell patchclamp technique. Results Obestatin of 10-7mol/L increased the contraction amplitude of ventricular myocytes (26.43±6.13)% and Ca2+ transient amplitude (21.33±4.73)%， and enhanced ICaL peak. Conclusion Obestatin can strengthen contractility through increasing ICaL and Ca2+ transient in rat ventricular myocytes.

　　KEY WORDS: obestatin; ventricular myocyte; calcium transient; Ltype Ca2+ currentSupported by the National Natural Science Foundation of China (No.30930105， No.30873058) and the Scitech Research and Development Project of Shaanxi Province (2008k1304); Natural Science Basic Research Plan in Shaanxi Province of China (No.2005c252)

　　肥胖抑制素(obestatin)是一种新发现的含有23个氨基酸的生长素(ghrelin)相关肽，与ghrelin来自同一基因[1]，可与孤儿G蛋白受体GPR39结合。这种新肽具有与ghrelin不同、甚至相反的生理和药理学作用，具有抑制摄食和降低体重，减慢胃排空速度和抑制肠道收缩等效应，被认为是ghrelin的生物学拮抗剂或阴阳活性多肽。研究发现，ghrelin对心血管系统发挥多种生理作用，健康人静脉注射ghrelin可以明显降低平均动脉压，增加心输出量而不改变心律，且对慢性心衰患者具有相同的效应[2]。那么obestatin是否具有心血管效应呢?本文采用单细胞动缘探测技术及全细胞膜片钳技术观察obestatin对大鼠心室肌细胞收缩功能、L型钙电流及细胞内钙瞬变的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康成年雄性Wistar大鼠(250±50)g，澳大利亚昆士兰大学实验动物中心提供。

　　1.2 试剂和溶液 胶原酶Ⅱ(collagenase Ⅱ)购自美国Worthington Biochemical公司，Fura2/AM购自美国Invitrogen公司，obestatin购自澳大利亚Alexis Biochemicals公司。其他试剂均购自Sigma公司或Merck公司。

　　正常台氏液(mmol/L)：NaCl 136.9，KCl 5.4，MgCl2 1.0，HEPES 10，Nah3PO4 0.33， glucose 10.0，pH用NaOH调至7.4;KB液(mmol/L)：KCl 25;taurine 20;Lglutamic acid 70;Kh3PO4 10;MgCl2 3.0;EGTA 0.5;glucose 10;HEPES 10;pH用KOH调至7.35;记录钙电流细胞外液(mmol/L)：NMDG 136， CsCl 5.4， MgCl2 1.0，CaCl2 2.0，Nah3PO4 2.0，glucose 10，HEPES 10，pH用NMDG调至7.3;记录钙电流电极内液(mmol/L)： CsCl 20，cesium aspartate 110，MgCl2 1.0，HEPES 10，EGTA 10，GTP 0.1，MgATP 5;pH 用CsOH 调至7.2。

　　1.3 方法

　　1.3.1 单个心室肌细胞的分离 常规酶解法分离成年大鼠心室肌细胞[3]。 其步骤简述如下：戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)麻醉后大鼠，迅速开胸取出心脏并固定于Langendorff灌流系统。经主动脉灌流(37℃)含氧无钙台氏液，心脏停跳后，换以含0.5g/L胶原酶Ⅱ和1g/L牛血清白蛋白(BSA)的无钙台氏液灌流约18min，待心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后再以KB液灌流冲洗残留酶液约3min。去除心房及主动脉并将心室组织置于含氧KB液中，将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经 250目筛网过滤细胞悬液，室温静置30min后复钙备用。

　　1.3.2 心肌细胞收缩的检测 心室肌细胞收缩采用IonOptix单细胞动缘探测系统(IonOptix 公司， 美国)同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变[6]。将心肌细胞置于倒置显微镜(Nikon)载物台上的细胞灌流小室内，以含氧台氏液(2mL/min，22℃)灌流。给予0.5Hz，5ms 波宽的电场刺激，场刺激由灌流槽两侧镶嵌的铂电极产生，细胞收缩影像通过40×物镜传输到IonOptix的MyoCam照相系统并呈现在监视器上。心肌细胞肌小节收缩幅度和收缩/舒张速度等指标由计算机自动实时采集并记录。选取细胞边缘折光性好、横纹清晰、无自发收缩、功能良好能随电刺激稳定收缩的心室肌细胞进行实验观察。给药前细胞收缩幅度恒定至少5min以上。

　　1.3.3 心肌细胞钙瞬变的检测 将 Fura2/AM(0.5μmol/L)与心肌细胞避光孵育15min(22℃)，采用双激发荧光光电倍增系统(IonOptix，美国)检测荧光信号，75W紫外氙光灯发射的光通过340或380nm 的滤光片到达0.5Hz刺激下收缩的心肌细胞，细胞内与游离Ca2+结合的荧光物质被激发，其发射光在510nm处被检测并通过光电倍增管记录，细胞相继迅速被340nm和380nm激发光照射并交替扫描，细胞内游离Ca2+浓度的改变由上述两种波长荧光强度的比率反映。

　　1.3.4 膜片钳全细胞记录 选用有芯玻璃微电极(英国Harvard Apparatus公司)经P87型水平程控微电极拉制仪(美国Sutter公司)拉制而成，充填电极内液后阻抗在2～4Ω左右，取一滴心肌细胞悬液置于灌流槽中，用细胞外液持续灌流，流速为2mL/min，以冲去死亡细胞碎片，在倒置显微镜(奥林巴斯)下观察，选取表面光洁、横纹清晰、立体感强的心室肌细胞进行膜片钳全细胞记录，通过计算机由软件(pClamp7.0，美国Axon公司)经数/模(D/A)转换发放脉冲，通道电流信号经银丝引导由膜片钳负反馈放大器(Axopatch 200A，美国Axon公司)放大，再经模/数(A/D)转换后存放于计算机硬盘中，实验结果由Clampfit9.2软件分析。

　　1.4 数据统计与处理 数据均以±s表示，用SigmaPlot10.0软件处理，组间数据比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Obestatin对大鼠心室肌细胞收缩及细胞内钙瞬变的影响 单个心室肌细胞在基础场刺激下，稳定记录细胞收缩5min后，给予10-7mol/L obestatin明显增强心室肌细胞收缩幅度(26.43±6.13%，n=8，P=0.007)，冲洗掉obestatin后，收缩基本恢复到给药前水平(表1、图1)。同时观察到10-7mol/L obestatin增强心肌细胞内钙瞬变幅度(21.33±4.73%，n=6， P=0.043，表1、图2)。表明obestatin增强心肌细胞收缩力与ICaL的开放及肌浆网Ryanodine受体钙释放有关。表1 10-7mol/L obestatin对单个心肌细胞收缩和钙瞬变的影响

　　2.2 Obestatin对大鼠心室肌细胞ICaL的影响 给予钳制电压-80mV，阶跃间隔10mV，从-60mV去极化到+60mV，持续时间300ms。给予10-7mol/L obestatin后，ICaL峰值(0mV)电流从(9.23±2.41)pA/pF增加到(11.84±3.37)pA/pF(n=6， P=0.038，图3)。同时以峰电流密度(pA/pF)对膜电位作图，即得Ⅰ～Ⅴ曲线。加入obestatin后，ICaL的Ⅰ～Ⅴ曲线下移，其形状和峰值电压保持不变(n=6，图4)。

　　3 讨 论

　　Obestatin是新近发现的一种机体分泌的多肽分子。由于其与肥胖及相关疾病的密切关系，迅速成为研究的热点。本研究采用单细胞动缘探测技术及全细胞膜片钳技术，检测obestatin对心肌细胞收缩功能及细胞内钙的调节，结果证明obestatin增加大鼠心室肌细胞收缩幅度、细胞内钙瞬变及ICaL。

　　心肌细胞的收缩主要是由于细胞内游离钙[Ca2+]i增高引起的，[Ca2+]i增高的多少是心肌收缩力和心输出量的主要调节机制。而胞质[Ca2+]i主要来自于胞外钙内流和肌浆网(sacroplasmic reticulum， SR)的钙释放。心肌细胞膜上ICaL开放，细胞外钙离子内流，并触发SR Ryanodine受体开放，使细胞内游离钙浓度增加，引起肌钙蛋白产生一次收缩，收缩完成后细胞内游离钙再由胞质转入肌浆网，或经Na+Ca2+交换转出胞外，完成一次心动过程[7]。本研究以荧光比率(F340/F380)变化反映[Ca2+]i变化，结果表明obestatin增加单个心室肌细胞收缩的同时增加细胞内钙瞬变。

　　本研究首次应用全细胞膜片钳技术，观察Obestatin对大鼠心室肌细胞电压依赖的ICaL的影响。结果显示obestatin增强心肌细胞膜ICaL。进一步提示obestatin可以通过开放心肌细胞膜上ICaL，促进细胞外钙离子进入细胞内，同时促进Ryanodine受体开放，升高细胞内[Ca2+]i ，从而增强心肌细胞收缩。

　　Obestatin作为一种新发现的肽，其与心血管疾病的关系鲜有报道。随着对其受体及生物学作用研究的展开，陆续出现许多矛盾不一甚至相反的结果和结论，引发了相当激烈的争论。Obestatin与ghrelin来自同一个基因，同一mRNA，同一前体多肽，却具有与ghrelin完全相反的生物学效应[1，4]，而且能拮抗ghrelin的作用。有研究报道，ghrelin及其合成类似物可以浓度依赖性的增强心肌收缩力及心搏出量，且与激活细胞膜电压依赖性钙电流，促进钙内流有关[8]。本研究发现obestatin具有与ghrelin类似的心血管作用，与通常人们所认为的相反作用并不一致。但是，研究结果仍表明obetatin具有直接的心血管作用，其生物学特性及机制仍有待于进一步研究。

参考文献

[1]ZHANG JV， REN PG， AVSIANKRETCHMER O， et al. Obestatin， a peptide encoded by the ghrelin gene， opposes ghrelin's effects on food intake [J]. Science， 2005， 310(5750):996999.

　　[2]CAO JM， ONG H， CHEN C. Effects of ghrelin and synthetic GH secretagogues on the cardiovascular system [J]. Trends Endocrinol Metab， 2006， 17(1):1318.

　　[3]LU J， ZANG WJ， YU XJ， et al. Effects of postconditioning of adenosine and acetylcholine on the ischemic isolated rat ventricular myocytes [J]. Eur J Pharmacol， 2006， 549(13):133139.

　　[4]NUNES S， NOGUEIRASILVA C， DIAS E， et al. Ghrelin and obestatin: Different role in fetal lung development [J]? Peptides， 2008， 29(12):21502158.

　　[5]TANG SQ， JIANG QY， ZHANG YL， et al. Obestatin: its physicochemical characteristics and physiological functions [J]. Peptides， 2008， 29(4):639645.

　　[6]BERS DM. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes [J]. Annu Rev Physiol， 2008， 70:2349.

　　[7]XU XB， CAO JM， PANG JJ， et al. The positive inotropic and calciummobilizing effects of growth hormonereleasing peptides on rat heart [J]. Endocrinology， 2003， 144(11):50505057.