依曲替酸对寻常型银屑病皮肤IFNγ、IL4 mRNA表达的影响

　　　　 作者：牛新武，曹伟，冯捷，马慧群，袁景奕

【摘要】 目的 探讨依曲替酸治疗寻常型银屑病(psoriatic vulgaris， PV)的作用机制。方法 观察依曲替酸对30例PV患者的临床疗效，并用原位杂交技术对患者治疗前后皮损中Th1型细胞因子干扰素γ(IFNγ)和Th3型细胞因子(IL4)mRNA进行检测。结果 依曲替酸能改善PV患者病情，有效率76.67%。IFNγ、IL4 mRNA主要在真皮表皮交界处的淋巴细胞胞质中表达，IFNγ mRNA的表达治疗前(45.61±9.96)明显高于正常对照(4.40±1.20，P<0.01)，治疗后(16.82±7.20)明显下降(P<0.01)。IL4 mRNA表达无显著变化。结论 依曲替酸治疗PV的作用机制可能与其抑制皮肤中IFNγ mRNA的表达及调节Th平衡有关。

【关键词】 寻常型银屑病;维A酸;依曲替酸;Th细胞

　　ABSTRACT: Objective To explore the therapeutic mechanism of acitretin for psoriatic vulgaris (PV). Methods The clinical effects of acitretin on 30 patients with PV were observed， and the IFNγ mRNA/IL4 mRNA expression in PV patients skin lesions before and after the treatment was detected by hybrization in situ method. Results The skin inflammation of PV patients was greatly improved with a total efficiency of 76.67%. The expression of IFNγ mRNA/IL4 mRNA was detected principally in the lymphocytes at dermoepidermal junction. Prior to the treatment， the expression of IFNγ mRNA (4.40±1.20) was significantly higher than that in the healthy controls (4.40±1.20)(P<0.01). After the treatment， the expression of IFNγ mRNA (16.82±7.20) was decreased significantly (P<0.01)， but that of IL4 mRNA did not change significantly. Conclusion The therapeutic effects of acitretin may be associated with the inhibition of IFNγ mRNA expression and regulation of dermal Th balance.

　　KEY WORDS: psoriatic vulgaris; retinoid; acitretin; Th cell

　　银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，病因及发病机制尚不清楚。但是，大量的研究结果显示，银屑病很可能是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，在其发病机制中辅助性T(Th)细胞平衡紊乱起着至关重要的作用[1]。多种维A酸类药物在银屑病的治疗中取得了较好的效果，然而其具体作用机制至今尚不明确。关于维A酸治疗银屑病过程中，是否涉及到对Th细胞平衡的影响尚未见明确报道。本研究采用原位杂交方法，检测了Th1型细胞因子干扰素γ(IFNγ)和Th3型细胞因子白细胞介素4(IL4)在依曲替酸(阿维A)治疗前后寻常型银屑病皮损区的mRNA表达变化，从而了解依曲替酸在治疗银屑病中，是否影响了Th的平衡。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例资料 收集2007年1月至2008年12月我院皮肤科门诊诊断为中重度寻常型银屑病的患者(银屑病范围及严重程度评分PASI>7)30例，其中男13例，女17例，年龄20～69岁，平均35.95岁，病程3月～21年。入选标准：①临床及组织病理确诊为寻常型银屑病。②3月内未使用维A酸类药物、糖皮质激素及免疫调节剂等系统治疗，3月内无皮损局部用药;③入选病例签署知情同意书。排除标准：①有严重心、肝、肾疾患，糖尿病、高血压、高血脂、恶性肿瘤患者。②育龄期妇女3年内准备妊娠者、孕妇及哺乳期妇女。对照组正常皮肤来自我院外科，共13例(男8例、女5例)，年龄18～58岁。

　　1.2 治疗方法 依曲替酸(即阿维A，重庆华邦制药)10mg/次，2次/日，餐后口服，共8周。治疗初始、4周末、8周末检查血尿常规、肝功、血脂。治疗前后各进行PASI评分1次。

　　1.3 标本取材 银屑病患者经阿维A治疗前和治疗8周后皮损及外科手术切取的新鲜正常皮肤，40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋。

　　1.4 原位杂交法检测IFNγ mRNA、IL4 mRNA 原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。人IFNγ靶基因mRNA序列为：5′TACGTCTCG

　　ACTTTTCGGTTCTATATTGAA3′;5′AAGAC

　　AGTGAGAGGAGAAAGGTTAAGAAGT3′; 5′

　　ACGAGCCGCTGGAGCTTTGTCGTAGACTGA3′。

　　IL4靶基因的mRNA序列为：5′GACAAGAAGGACGATCGTACACGGCCGTTG3′;5′CTCTTTATAAGTTTCACAAGCTCGACTTAT3′。所有试剂的配制均需要使用焦磷酸二乙酯(sodium acid pyrophosphate， DEPC)，以防RNA酶对mRNA的降解作用。6μm厚石蜡切片置于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，脱蜡水化后用30mL/L双氧水孵育10min，DEPC水洗6min;胃蛋白酶消化30min，原位杂交用PBS洗3次×5min，蒸馏水洗1次，以暴露mRNA片段;经后固定，每片加预杂交液20μL，42℃孵育2h后，加相应寡核苷酸探针42℃孵育过夜;2×SSC洗涤2次×10min，0.5×SSC洗涤1次×15min，0.2×SSC洗涤2次×15min，滴加封闭液37℃封闭30min，滴加生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1h，滴加生物素化过氧化物酶37℃孵育20min，二氨基联苯胺(3，3′diaminobenzidine， DAB)染色，苏木素复染。阴性对照用预杂交液代替杂交液。判断标准：阳性细胞胞质着色呈棕黄色。在相同放大倍数下(×400)每张切片随机选取5个视野，观察计数每个视野的阳性细胞数。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计分析软件，数据采用±s表示，并做t检验，患者与正常对照之间的比较采用成组t检验，患者治疗前后的比较采用配对t检验，P<0.05认为有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 依曲替酸治疗银屑病的临床疗效 30例患者在治疗过程中均出现不同程度的口干、唇炎，皮肤干燥、瘙痒者16例，2例出现轻度血脂增高，3例出现轻度谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)增高，未作特殊处理，停药后上述不良反应渐消失。30例患者经8周治疗有效者为23例(有效为痊愈+显效，PASI评分下降≥80%为痊愈、PASI评分≥60%为显效)，有效率为76.67%，痊愈率为53.33%。

　　2.2 依曲替酸治疗对银屑病皮损区IFNγ mRNA及IL4 mRNA表达的影响 银屑病皮损真皮表皮交界处IFNγ mRNA及IL4 mRNA主要在淋巴细胞胞质中表达，这些阳性细胞呈群集现象，且在血管周围较多(图1)。依曲替酸治疗前银屑病皮损区真皮表皮交界处IFNγ mRNA阳性表达细胞数量较正常人皮肤明显增加，治疗后数量较治疗前明显减少;依曲替酸治疗前后IL4 mRNA阳性细胞数量与正常对照无显著性差异，治疗后较治疗前数量无显著性差异;治疗后的IFNγ mRNA阳性细胞/IL4 mRNA阳性细胞比值较治疗前明显下降(表1)。表1 依曲替酸治疗对银屑病皮损真皮表皮交界处IFNγ、IL4 mRNA表达的影响

　　3 讨 论

　　维A酸类药物在皮肤科被广泛用于治疗角化异常性疾病、痤疮、光老化及银屑病等皮肤病[2]，其中用于银屑病治疗的药物有依曲替酸(阿维A)、依曲替酯和他扎罗汀等。依曲替酸是临床上口服治疗中、重度银屑病最常用的药物之一。大量临床资料显示，该药治疗银屑病疗效肯定，但其体内作用机制目前尚不明确[3]。银屑病是皮肤科常见的一种慢性炎症性皮肤病，至今病因及发病机制还不完全清楚。越来越多的证据提示，该病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，其中辅助性T(Th)细胞平衡紊乱在其发病过程中起着至关重要的作用[1]。近期研究结果显示，维A酸能够影响Th细胞的分化和功能[45]，而维A酸治疗银屑病过程中是否涉及对Th细胞的影响，尚未见明确报道。

　　本研究结果显示，依曲替酸治疗8周后，多数患者的病情得到明显缓解，有效率达76.67%。该结果与国内的相关报道一致[67]。在银屑病皮损区中，Th1型细胞因子IFNγ mRNA表达明显高于正常人，INFγ mRNA阳性细胞/IL4 mRNA阳性细胞的比值在银屑病皮损中也明显增高。这再次印证了银屑病患者皮损中存在Th细胞平衡紊乱。此外，IFNγ mRNA、IL4 mRNA的表达主要集中在真皮表皮交界处的淋巴细胞，并且这些细胞呈群聚性分布，以扩张的毛细血管周围最为明显。

　　在依曲替酸治疗8周后，皮损区Th1型细胞因子IFNγ mRNA表达显著减少。从而提示，在依曲替酸治疗银屑病的过程中可能抑制了IFNγ基因的表达及转录。而皮损区Th3型细胞因子IL4 mRNA的表达在治疗前后无显著变化，说明该药对Th3型细胞因子的表达影响较小。因此，依曲替酸至少部分是通过抑制Th1型细胞，纠正银屑病皮损区Th细胞平衡紊乱，而Th3型细胞在该过程中可能不起关键作用。然而，依曲替酸具体是通过何种机制实现对Th1型细胞的抑制，以及其中是否涉及到维A酸受体机制等问题，尚待进一步研究。

参考文献

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