全反式维甲酸与奥沙利铂在诱导人胃癌　BGC823细胞凋亡中的协同作用

　　　　 作者：邵应举，郑玉玲，樊青霞，赵培荣

【摘要】 目的 观察全反式维甲酸(ATRA)与奥沙利铂(LOHP)对人胃癌BGC823细胞增殖的影响。方法 分别用ATRA和LOHP单独及联合作用于人胃癌BGC823细胞，采用MTT法检测细胞增殖抑制率，倒置显微镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期;免疫细胞化学技术检测BGC823细胞中Bcl2和Survivin蛋白的表达情况。结果 ATRA作用后BGC823细胞的增殖受到抑制，细胞形态发生了改变，凋亡比例明显增加;与LOHP联用后，该作用加强。胃癌 BGC823细胞中Bcl2和Survivin蛋白的表达在ATRA作用后均受到抑制，ATRA与LOHP联合作用后蛋白表达的阳性率进一步降低。结论 ATRA能抑制人胃癌BGC823细胞的生长，与LOHP联用具有协同抑制作用，其机制可能与下调Bcl2和Survivin蛋白表达有关。

【关键词】 全反式维甲酸;奥沙利铂;胃癌BGC823细胞;凋亡;Bcl2;Survivin

　　ABSTRACT: Objective To observe the effects of alltrans retinoic acid (ATRA) and oxaliplatin (LOHP) on the proliferation of human gastric cancer BGC823 cells. Methods Human gastric cancer cells BGC823 were treated with ATRA and/or LOHP， respectively. The cell proliferative activity was assessed by MTT assay. Cell morphological changes were observed under inverted microscope while apoptosis rate and cell cycle were assayed by flow cytometry. The expressions of Bcl2 and Survivin protein were detected by immunocytochemistry. Results The proliferation of the cells treated with ATRA was inhibited obviously and the morphology of the cells changed. The apoptosis rate of BGC823 cells increased gradually and the effect was enhanced when ATRA was combined with LOHP. After treatment with ATRA， the expressions of Bcl2 and Survivin protein in BGC823 cells were both downregulated obviously. With the combination of ATRA and LOHP， the expressions both further decreased. Conclusion ATRA can inhibit the proliferation of human gastric cancer BGC823 cells， and the inhibitory effect is synergistic when ATRA is combined with LOHP. The mechanism might be related to the downregulation of Bcl2 and Survivin protein expressions.

　　KEY WORDS: alltrans retinoic acid; oxaliplatin; human gastric cancer BGC823 cell; apoptosis; Bcl2; Survivin

　　全反式维甲酸(alltrans retinoic acid， ATRA)是维生素A的主要代谢产物，能够诱导肿瘤细胞的分化，抑制肿瘤细胞生长。ATRA最初用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，近年来已有报道其对消化道肿瘤也有明显治疗作用。奥沙利铂(LOHP)是第3代铂类抗癌化合物，现阶段已被广泛地应用于消化道肿瘤的化疗[1]。ATRA与LOHP联合作用于胃癌是否能够提高疗效，目前未见报道。本研究旨在探讨ATRA与LOHP联用是否可以增强对人胃癌BGC823细胞的抑制作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 ATRA(美国Sigma公司)避光下用无水乙醇配制成10-2mol/L，过滤除菌后-20℃冰箱避光贮存备用;LOHP(江西恒瑞制药公司)用三蒸水配制成1mg/mL，过滤除菌后4℃冰箱贮存备用;MTT(美国Sigma公司)用PBS液配制成5mg/mL，过滤除菌后4℃冰箱贮存备用;DMSO系美国Sigma公司产品;流式细胞仪系美国BD公司产品;人胃癌BGC823细胞由郑州大学第一附属医院肿瘤实验室提供，常规培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在100%湿度、50mL/L CO2、37℃恒温培养箱中培养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基，置100%湿度、50mL/L CO2、37℃恒温培养箱中培养。隔天换液1次，每4d传代1次，传代时用2.5g/L胰酶溶液消化。

　　1.2.2 MTT实验 取对数生长期细胞，调整密度至3×104/mL，接种于96孔板，分为4组：对照组(1mL/L的无水乙醇)、ATRA组(10-5mol/L)、LOHP组(80mg/L)和联合组(ATRA终浓度为10-5mol/L、LOHP终浓度为80mg/L)。每个浓度设5个复孔。加药后24、48、72h于倒置显微镜下观察细胞形态变化。加MTT溶液，4h后加DMSO 150μL，检测490nm处各孔的A值。细胞生长抑制率(%)=(1-药物组A值均值/对照组A值均值)×100%。

　　1.2.3 流式细胞术 取对数生长期细胞，按5×105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药;作用48h后消化收集细胞，700mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞周期及细胞凋亡测定。

　　1.2.4 免疫细胞化学 取对数生长期细胞，按5×104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药;作用48h后40g/L多聚甲醛固定，TritonX100透化，山羊血清封闭;加1抗(Bcl2抗体稀释度为1∶100，Survivin抗体稀释度为1∶100)，4℃过夜，滴加2抗孵育;DAB显色，封片，拍照。

　　1.2.5 统计学分析 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学的变化 倒置显微镜下可见，正常细胞生长良好，呈多边形，胞体透亮;ATRA作用24h后，细胞间隙增宽，胞内颗粒增多，出现空泡;作用48h后，多数细胞漂浮于培养液中，少量仍贴壁生长，并可见部分细胞断裂成碎片，呈凋亡改变;作用72h后，凋亡细胞数量继续增多，但不明显。联合组作用48h后细胞凋亡明显增加，72h后凋亡增加亦不明显。

　　2.2 ATRA、LOHP对BGC823细胞的生长抑制作用 MTT法结果显示，ATRA可以抑制BGC823细胞增殖，作用48h后抑制最为明显;与LOHP联用后增殖抑制作用更显著(P<0.05，表1)。表1 ATRA及LOHP对BGC823细胞的生长抑制作用与对照组相比*P<0.05;与LOHP组相比，△P<0.05。

　　2.3 ATRA、LOHP对BGC823细胞周期及细胞凋亡的影响 流式细胞结果显示，ATRA作用于BGC823细胞后出现G0/G1期阻滞;与LOHP联用后出现G0/G1期和G2/M期阻滞，凋亡比例明显增加(P<0.05，图1、图2、表2)。

　　2.4 ATRA、LOHP对BGC823细胞Survivin和Bcl2蛋白表达的影响 免疫细胞化学法测定的结果判定：光镜下观察阳性颗粒呈棕黄色，主要分布在细胞质内。每张玻片随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。结果显示，ATRA可以下调BGC823细胞Bcl2蛋白和Survivin蛋白的表达;联合应用ATRA和LOHP后，Bcl2蛋白和Survivin蛋白表达明显受到抑制(P<0.05，图3、图4、表3)。表2 ATRA及LOHP对BGC823细胞周期及细胞凋亡的影响表3 ATRA及LOHP对BGC823细胞Bcl2和Survivin蛋白表达的影响与对照组相比，*P<0.05;与ATRA组相比，△P<0.05;与LOHP组相比，#P<0.05。

　　3 讨 论

　　细胞增殖和凋亡调节失控是肿瘤发生的主要原因。近年的研究表明，很多抗癌药是通过诱发肿瘤细胞凋亡来发挥作用的[2]。国内外研究证实，ATRA是一种作用较强的分化诱导剂，可调节肿瘤细胞的生长、分化，能诱导多种肿瘤细胞凋亡，具有显著的抗肿瘤作用[3]。ATRA诱导肿瘤细胞凋亡是一个多基因参与调控的过程[4]。ATRA在临床上除了用于治疗白血病之外，也已经用于其他肿瘤的治疗，如甲状腺癌、肝癌、大肠癌等[57]。本研究结果显示，与对照组相比，ATRA组的48h和72h抑制率均有显著性差异(P<0.05)，说明ATRA对BGC823细胞有抑制作用;联合组的抑制率与LOHP组相比，48h和72h均有显著性差异(P<0.05)，表明ATRA与LOHP联合具有协同抑制作用。

　　研究表明，ATRA可以产生G1阻滞[8]，而高浓度的LOHP可以出现G2/M阻滞[9]。本实验采用流式细胞术双染色法进行检测，结果显示，ATRA作用细胞后G0/G1期的细胞比率增加，S期的细胞比率下降;LOHP作用细胞后G2/M期细胞比率增加，G0/G1期的细胞比率下降;联合组作用细胞后G0/G1期和G2/M期细胞比率均增加。各实验组的凋亡率与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，且联合组与ATRA组、LOHP组相比，凋亡率有统计学差异(P<0.05)。可见ATRA能阻滞BGC823细胞由G1期向S期转变，使DNA合成受阻，细胞不能进入分裂周期从而使得G0/G1期细胞蓄积增多。而联合用药后细胞G0/G1期和G2/M期细胞比率均增加，细胞DNA合成和有丝分裂均受阻，细胞增殖受抑制，细胞凋亡增加。流式细胞术结果表明，ATRA能调节细胞周期和诱导细胞凋亡，与LOHP联合后在诱导细胞凋亡中发挥协同作用。

　　Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族新成员，许多资料表明其过度表达及其导致的凋亡抑制在肿瘤的发生和发展中起了极其重要的作用[10]。Survivin可选择性的在人类多种肿瘤组织表达，而在癌旁正常组织和成人分化组织中并不表达。现已发现，Survivin在包括肝癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表达，同时在正常组织中表达阴性[11]。而Bcl2被认为是细胞凋亡基因家族中最重要的调控基因[12]。在许多肿瘤中可见Bcl2的过度表达，包括约70%的乳腺癌、约30%～60%的前列腺癌、约90%的结肠癌、约60%的胃癌、100%的小细胞肺癌及约80%的B淋巴细胞癌中均有此现象[13]。KAWASAKI等发现大肠癌组织中Survivin的表达与Bcl2的表达及凋亡指数的降低密切相关。王梅等[14]应用免疫组化技术检测出Survivin阳性表达与Bcl2的过表达密切相关。本实验中免疫细胞化学结果显示，对照组中可以见到细胞质中较多的Bcl2蛋白和Survivin蛋白表达，呈浅黄色到棕黄色颗粒;ATRA组和LOHP组阳性表达细胞数减少;联合组的阳性表达数更少。联合组与ATRA组、LOHP组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。应用ATRA及LOHP后，细胞中Bcl2蛋白和Survivin蛋白表达受到抑制，表明ATRA和LOHP可以诱导人胃癌BGC823细胞凋亡，其机制可能与下调Bcl2蛋白和Survivin蛋白表达有关。

参考文献

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