HMGCoA还原酶抑制剂阿托伐他汀对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制

　　　　 作者：赵锡丽，徐蔚蔚，蒋国萍，刘小兰，戟芳

【摘要】 目的 探讨HMGCoA还原酶抑制剂阿托伐他汀对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制。方法 采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法复制大鼠糖尿病(DM)模型，成功后随机分为模型对照组和阿托伐他汀治疗组，另设正常对照组，每组8只大鼠。于处理后的第1、2、4、8周分别检测各组大鼠的24h 尿白蛋白(UAL)、尿素氮(UN)和肌酐(Cr)水平。第8周，取大鼠肾组织和外周血。采用Western blot法检测大鼠肾脏组织中Smad2蛋白的表达;免疫组化法检测大鼠肾脏组织中TGFβ1蛋白的表达;放射免疫法检测血清中层粘连蛋白(LN)的表达。结果 从第1周开始，与正常对照组比较，模型对照组和阿托伐他汀治疗组大鼠24h UAL、UN和Cr水平明显升高(P<0.01);而从第4周开始，与模型对照组比较，阿托伐他汀治疗组大鼠24h UAL、UN、Cr明显降低(P<0.01)。与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾组织中Smad2蛋白水平虽有升高，但无统计学差异(P>0.05);而与模型对照组比较，阿托伐他汀治疗组Smad2蛋白表达明显降低(P<0.01)。与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾组织中TGFβ1的表达量明显增加;而与模型对照组比较，阿托伐他汀治疗组TGFβ1阳性细胞数量则明显减少。模型对照组大鼠血清LN水平较正常对照组明显升高(P<0.01);而阿托伐他汀治疗组的LN表达水平较模型对照组明显降低(P<0.05)。结论 HMGCoA还原酶抑制剂阿托伐他汀可能通过抑制TGFβ1/Smad信号通路，从而达到对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。

【关键词】 阿托伐他汀;糖尿病;大鼠;肾功能;TGFβ1/Smad信号通路

　　ABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of hydroxymethylglutaryl coenzyme A (HMGCoA) reducase inhibitor atorvastatin on nephridial tissues of diabetic rats and its possible mechanism. Methods Streptozotocin (STZ) was injected intraperitoneally to establish rat diabetes mellitus (DM) model. Then the rats were randomized into model group and atorvastatin treatment group after the establishment of DM model. Meanwhile， normal control group was set and there were 8 rats in each group. The levels of urinary albumin (UAL)， urea nitrogen (UN) and creatinine (Cr) during 24h were recorded respectively after the treatment. After 8week treatment， the rats were sacrificed. Then， the nephridial tissues and peripheral blood (PB) samples were collected. The sera were separated from PB. Western blot was used to determine the level of Smad2 protein expression in the nephridial tissues. We employed immunohistochemistry to assay the percentage of TGFβ1 in the nephridial tissues and radioimmunity (RI) to measure laminin (LN) products in the sera in the groups. Results From the first week after treatment， the levels of UAL， UN and Cr during 24h in model group and atorvastatin treatment group were significantly increased compared with those in the normal control group (P<0.01). From the fourth week after treatment， the levels of UAL， UN and Cr during 24h were decreased significantly in atorvastatin treatment group compared with those in model group (P<0.01). Compared with the normal control group， Smad2 level in nephridial tissues of model control group was enhanced， but without significant differences (P>0.05). Atorvastatin treatment could decrease significantly the level of Smad2 expression in nephridial tissues compared with model control group (P<0.01). The expression of TGFβ1 in nephridial tissues in model control group was remarkablyenhanced compared with that in the normal control group. The number of TGFβ1 positive cells was smaller in atorvastatin treatment group than in model control group (P<0.05 ). Serum LN level increased more obviously in model control group than in the normal control group. Meanwhile， atorvastatin treatment efficiently reduced LN level compared with model control group (P<0.05). Conclusion HMGCoA reducase inhibitor atorvastatin might protect nephridial tissues of diabetic rats via suppressing TGFβ1/Smad signal transduction pathway.

　　KEY WORDS: atorvastatin; diabetes; rat; renal function; TGFβ1/Smad signal pathway 糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病最常见和最严重的并发症，是引起肾功能衰竭的主要原因之一，同时还可引起微血管和大血管疾病等2次并发症[13]。研究证实，转化生长因子β(TGFβ)在DN的发病中起着重要的作用[4]，其作用机制可能与其下游丝/苏氨酸激酶受体(Smad)信号通路有密切的关系[5]。

　　近来研究发现，脂质代谢紊乱是DN 的重要危险因素之一[6]。研究表明，高脂可作为始动因素对肾脏具有直接致病性，其机制可能与TGFβ1/Smad信号通路的激活相关[7]。基于上述研究，我们采用具有降血脂作用的HMGCoA还原酶抑制剂阿托伐他汀作用于糖尿病大鼠，探讨其对TGFβ1/Smad信号通路的影响，从而为临床应用阿托伐他汀治疗DN提供一定的理论和实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型的复制及分组给药 雄性 SD大鼠30只，体重(210±10)g，购于第三军医大学实验动物中心，分笼饲养在22～28℃动物室中，给予标准鼠食及自由饮水。适应性饲养1周后随机选取20只大鼠，采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法复制糖尿病模型。大鼠随机血糖均大于16.7mmol/L，持续2周以上，即表明模型复制成功。非糖尿病(正常)SD大鼠枸橼酸盐缓冲液(0.1mol/L、pH 4.5)腹腔内注射。将阿托伐他汀用生理盐水稀释成0.5mg/mL备用。正常对照组不予任何处理;阿托伐他汀治疗组予以10mg/kg灌胃，模型对照组给予相同容积的生理盐水灌胃，连续8周。

　　1.2 药品及主要试剂 阿托伐他汀钙片购自北京红惠生物制药股份有限公司;STZ购自Sigma公司;尿微量白蛋白测定试剂盒、肌酐测定试剂盒均购于中生公司;血清层粘连蛋白(LN)放免试剂盒由上海海军医学研究所提供。TGFβ1 SABC免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物公司;Western Blot Smad2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;ECL检测试剂盒购自江苏海门生物科技有限公司。

　　1.3 主要仪器 稳豪2代血糖仪及其配套试纸(美国强生公司);Cobas MIRA plus全自动生化分析仪(瑞士);MiniPROTEAN 3小型垂直电泳槽、Smart SpecTM 3000型核酸蛋白定量分析仪、785型真空转膜仪(美国BioRad公司);RM2135型超薄组织切片机、DMIRB型倒置显微镜、MPS30型照相机(德国Leica公司)。

　　1.4 样本收集 于给药处理后第1、2、4、8周将各组大鼠按组别依次放入代谢笼中，收集24h尿，检测尿蛋白(UAL)、尿素氮(UN)水平;尾静脉采血检测肌酐(Cr)含量。于末次给药后12h，麻醉大鼠，取外周血并在4℃下、3000r/min离心10min分离血清，-20℃贮存备用。取大鼠双侧肾脏，一侧采用40g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋行冰冻切片，准备免疫组织化学检测;另一侧肾组织，PBS冲洗干净后，液氮冻藏，待提取组织蛋白做Western blot检测。

　　1.5 方法

　　1.5.1 生化检查 收集大鼠各时相点24h尿，检测UAL、UN含量;检测血标本Cr水平。UAL测定：取标本10mL，3000r/min离心10min，取上清10μL，然后依次加入缓冲液250μL、抗血清50μL，37℃检测，检测波长340nm。Cr测定采用Jaffes法，尿标本预先用生理盐水稀释30倍后进行测定。

　　1.5.2 免疫组织化学染色 石蜡包埋标本行冰冻切片，制成5μm厚切片，二甲苯脱蜡水化后，30mL/L h3O2灭活内源性酶;PBS洗3次，1min/次;分别与一抗(兔抗大鼠TGFβ1单克隆抗体，1∶3000)、二抗(生物素标记羊抗兔IgG，1∶1000)及辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素复合物(1∶400)孵育;PBS洗3次，2min/次;苏木素复染核5～10min;水洗、分化、蓝化、脱水、透明并封固，镜下观察。每张切片于400倍光镜下随机选取不重复的20个肾小球，观察阳性染色细胞的着色情况。

　　结果判定标准：以细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。计算阳性细胞百分率，根据阳性细胞百分率及染色强度进行分级。阳性细胞数占10%～25%时标记为“+”;棕色颗粒较深， 阳性细胞占26%～50% 标记为“”;棕色颗粒量多、深棕色，阳性细胞占50%以上标记为“”;阳性细胞数<10%为阴性。

　　1.5.3 大鼠肾脏组织总蛋白的提取及Western blot检测 取约200mg组织置玻璃匀浆器内，立即加入150μL预冷的蛋白裂解液(Pierce公司)，剧烈振荡15s，冰浴10min;超声破碎细胞，80W、3次，每次约5s;12000r/min、4℃离心10min。按PIERCE蛋白测定试剂盒说明进行蛋白质定量，样本分装于-80℃冰箱中保存备用。将提取液的蛋白浓度调整一致，各取50μg蛋白经100g/L十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)后，半干电转移法(20V，15min)转至ECL膜上(Pierce公司)。

　　转膜结束后用含50g/L脱脂奶粉封闭6h，TBS洗膜3次，每次5min;分别加入兔抗大鼠Smad2多克隆抗体(58ku，1∶3000)和GAPDH单克隆抗体(36ku，1∶2000) (Santa Cruz公司)，4℃孵育12h;TBS洗膜2次，每次5min;加入辣根过氧化物(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶3000)，4℃孵育2h;TBS洗膜2次，每次5min，化学发光试剂盒显色，曝光，对Smad2表达情况进行检测。结果判断：以Smad2的灰度值与GAPDH的灰度值的比值表示Smad2蛋白的相对表达水平。

　　1.5.4 放射免疫法检测大鼠血清LN含量 采用GC911型放射免疫伽玛计数器进行检测，严格按照说明书操作。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS11. 0 统计学软件行统计学分析。所有计量资料均以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析比较组间差异。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各时相点各组大鼠24h肾功能指标的变化 在处理后的前2周，与正常对照组相比，模型对照组24h UAL、UN和Cr水平明显升高(P<0.05);而阿托伐他汀处理组上述指标与模型对照组之间无明显差异(P>0.05，表1);从第4周开始，与模型对照组相比较，阿托伐他汀治疗组大鼠24h UAL、UN和Cr水平明显降低(表1)。表1 各时相点各组大鼠24h尿白蛋白、尿素氮和肌酐的变化与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与模型对照组比较，#P<0.05。

　　2.2 大鼠肾脏组织TGFβ1蛋白的表达情况 正常大鼠肾脏TGFβ1蛋白的阳性表达颗粒主要见于肾小球和肾小管，且表达量较少(图1A);在上述部位，模型对照组的TGFβ1表达量明显增加，着色很深，呈现强阳性表达(图1B);阿托伐他汀治疗组虽仍有阳性表达颗粒，但明显少于且弱于模型对照组(图1C)。

　　2.3 大鼠肾脏组织Smad2蛋白的表达情况 与正常对照组相比，模型对照组大鼠肾组织中Smad2蛋白水平升高Smad2/GAPDH(1.367±0.081 vs. 1.233±0.064)，但差异无统计学意义(图2)。与模型对照组相比，阿托伐他汀治疗组大鼠肾组织中Smad2表达水平明显降低(0.438±0.055 vs. 1.367±0.081)，且差异具有统计学意义(P<0.01，图2)。

　　2.4 各组大鼠血清LN含量的变化 相对于与正常对照组[(109.53±16.84)ng/mL]，模型对照组大鼠血清LN水平[(153.67±26.31)ng/mL]明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01);而相对于模型对照组，阿托伐他汀治疗组大鼠血清LN含量[(136.48±22.95)ng/mL]明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　TGFβ超家族主要由TGFβ亚型(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)、激活素和骨形态发生蛋白(BMP)3大类组成，在调节细胞生长、分化等方面具有重要作用。多数情况下，TGFβ与潜在相关肽(LAP)形成无活性的前体复合体;在刺激性因素作用下，该前体复合体可脱去LAP而活化，与靶细胞膜上的TGF受体特异性结合发挥生物效应。

　　Smads是调节TGF与特异性受体结合的信号分子，根据结构和功能可分为受体调节型Smad、共同介质型Smad和抑制型Smad。研究发现，TGFβ/Smad参与了糖尿病肾脏的病理损伤过程[45]。AHN等[8]认为TGFβ1是肾组织发生纤维化的关键机制之一;METWALLY等[9]也认为TGFβ1表达过多是DN发病的关键因素，抑制TGFβ1蛋白的表达可明显延缓糖尿病肾脏的损害;PONCELET等[10]发现，人肾系膜细胞中Smad2、Smad3、Smad4被TGFβ所激活并参与调节Ⅰ型胶原的基因转录。在STZ所诱导的糖尿病鼠模型成功复制1周后，人们在肾小管和肾小球的细胞核中也观察到了表达增强的Smad3，且Smad3的表达水平随着时间推移而逐渐升高[11]。

　　本研究发现，在处理后第4、8周，阿托伐他汀治疗组24h尿蛋白排泄明显减少，肾功能得到有效改善。同时，阿托伐他汀可明显下调糖尿病大鼠肾组织中TGFβ1和Smad2的表达，降低大鼠血清中LN的含量。因此，选择性抑制TGFβ1/Smad信号通路的活化可以成为DN预防和治疗的一个有效的靶点。

　　作为HMGCOA还原酶抑制剂，他汀类药物可选择性阻断HMGCOA，其抑制脂质合成保护糖尿病肾脏的研究已见报道[12]。同时，抑制细胞内许多蛋白质的异戊二烯化修饰，从而影响细胞周期的调控及细胞外信号向核内传递[13]。因此，我们推测，在高脂驱动因素作用下，TGFβ1/Smad信号通路被迅速激活从而产生肾脏损伤作用。而在此时他汀类药物阿托伐他汀的介入则可从源头消除驱动因素，调控信号使其传递发生障碍，结果对TGFβ1/Smad信号产生抑制效应，产生降脂性肾脏保护效应。

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