Klotho蛋白在高血压发病中的作用

　　　　　　作者：何亚军，苏显明，王新阳

【摘要】 目的 探讨klotho蛋白在高血压发病中的作用。方法 收集我院2009年3月～2009年6月间住院的104例高血压和61例非高血压者血样本，采用ELISA方法检测klotho蛋白、硝基还原酶法检测一氧化氮(NO)。结果 高血压组klotho蛋白吸光度和NO水平低于非高血压组(P<0.01);klotho蛋白吸光度与NO、年龄存在相关性。结论 Klotho蛋白是一个与衰老相关的蛋白，可能通过一氧化氮机制参与高血压发病。

【关键词】 Klotho蛋白;一氧化氮;老年;高血压

ABSTRACT: Objective To investigate the role of klotho protein in the pathogenesis of hypertension. Methods We collected blood samples of 104 patients with hypertension and 61 people without hypertension admitted to our hospital between March and June 2009. Klotho protein and nitric oxide (NO) in blood serum were detected by ELISA and nitroreductase methods. Results Klotho protein absorbance and NO were lower in hypertension group than in nonhypertension group (P<0.01). Klotho protein absorbance was correlated with NO and age. Conclusion Klotho protein is a protein associated with aging. Klotho protein may be involved in the pathogenesis of hypertension through nitric oxide mechanism.

　　KEY WORDS: klotho protein; nitric oxide; aging; hypertension

　　高血压系人类常见病、多发病。高血压的发病是由多基因变异、环境和个体差异等诸多因素共同作用导致机体功能紊乱引起，其中多基因变异引起人们越来越多的关注。Klotho是最近研究发现的一种新基因，其主要在肾脏和脑表达。表达的蛋白在人和小鼠中均有膜结合型和分泌型两种形式，其中分泌型的表达量明显高于膜结合型。研究发现，klotho基因敲除鼠出生后4周龄左右出现动脉硬化和异位钙化，并随增龄而加重[2]。将klotho基因杂合子鼠和野生型鼠同时放在高压环境下20h后，发现杂合子鼠主动脉对乙酞胆碱松弛反应的有效剂量增高，小动脉对乙酞胆碱所引起的舒血管反应明显减弱[23]。一氧化氮(nitro dioxide， NO)是血管内皮细胞分泌的重要舒血管因子。研究表明，NO与高血压之间存在着密切关系[4]。我们推测，klotho可能与高血压发病有某种关联，并检测了高血压人群与非高血压人群血清klotho蛋白和NO水平的变化，以探讨klotho在高血压发病中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 本课题研究对象为2009年3月～2009年6月在西安交通大学医学院第一附属医院住院的老年心血管病患者165例，入院时均经过询问病史、体格检查、X线检查、心电图、超声心动图以及相关实验室检查等。排除急慢性肝肾疾病、肿瘤、脑血管病、周围血管性疾病等，按有无高血压分为2组：高血压组104例，非高血压组61例。两组临床情况见表1。高血压诊断标准：采用水银血压计测量患者右测上臂，不同时间3次血压均高于140/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)。表1 两组一般情况比较

　　1.2 方法 收取所有患者血液3～5mL后于2000r/min离心10min，吸取上清液于-80℃冰箱保存待测。①Klotho蛋白的检测：采用ELISA法。将患者血清按1∶10稀释后加入96孔板中，每孔0.1mL，4℃过夜。次日弃去孔内液体，用含有吐温20 PBS洗涤液清洗5次，加入英国abcom公司提供的抗klotho抗体(ab76356)，klotho抗体用含牛血清白蛋白PBS稀释，稀释比例1/12500，稀释后加入96孔板中，每孔0.1mL置入37℃温箱孵育1h，后弃去液体，用含有吐温20的PBS洗涤液清洗5次，加入辣根酶标记的山羊抗兔抗体，用含牛血清白蛋白PBS稀释，稀释比例1/2000，稀释后加入96孔板中，每孔0.1mL置入37℃温箱孵育1h，后弃去液体，用含有吐温20的PBS洗涤液清洗5次，加入新鲜配制成的TBM显色剂每孔0.1mL置入37℃温箱孵育30min，终止液终止反应，于美国产酶标仪(型号550)中测读。所有值至少重复检测2次。 ②NO的测定：用硝基还原酶法。采用南方建成生物有限公司提供的试剂盒，步骤严格按照说明书进行，检测使用韩国产Scinco紫外可见光分光光度计(型号SUV2120)，计算按说明书提供的计算公式计算结果。

　　1.3 统计学处理 所有数据均输入计算机，计量资料以均数±标准差(±s)表示，用SPSS17.0/PC软件包进行统计分析。两组间均数采用t检验，多组间均数采用F检验，指标间关系采用直线相关性分析。P<0.05为有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 年龄与klotho蛋白之间的关系 将年龄与klotho蛋白吸光度进行相关性检验，结果显示klotho吸光度随年龄增加而降低，两者存在负相关性(r=-0.316，P=0.043，图1)。

　　2.2 两组血清klotho蛋白的吸光度及NO水平 高血压组klotho蛋白吸光度为0.360±0.130，血清NO水平为(42.59±19.83)μmol/L，均低于非高血压组0.499±0.220及(65.81±22.75)μmol/L，两组间比较均有统计学差异(P<0.01，表2)。表2 高血压组与非高血压组血清klotho蛋白的吸光度与NO水平

　　2.3 klotho蛋白的吸光度与血清NO水平的相关性 将所有标本的klotho蛋白的吸光度与NO进行相关性检验，结果显示klotho吸光度随着血清NO水平的升高而增加，两者存在正相关性(r=0.223，P=0.018，图2)。

　　3 讨 论

　　Klotho基因是近年来发现的一种新型抗衰老基因。定位于染色体13q12区域[56]，其分泌性蛋白大约549氨基酸[7]。Klotho基因敲除后小鼠过早出现和人类衰老相关的多种行为和病理生理改变，如寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、肺气肿、骨质疏松、免疫功能降低等[811]。本研究对klotho蛋白与检测对象年龄之间的相关性分析发现，klotho蛋白随年龄的增长而下降(图1)，经统计学分析，两者间存在负相关性(r=-0.316，P=0.043)，说明klotho与衰老有关。

　　另有研究发现，腺病毒介导的klotho基因导入动脉粥样硬化模型鼠(OLETF)内(伴有高血压、肥胖、高血糖、高血脂)可以改善血管内皮功能障碍，增加NO的生产，降低血压升高，防止内膜肥厚和血管纤维化[12]。本研究观察了klotho蛋白的变化情况，发现在高血压与非高血压人群之间klotho蛋白均存在明显差异，高血压人群klotho蛋白均低于非高血压人群(P<0.01)，说明klotho蛋白在高血压的发病过程中起非常重要的作用。研究发现，NO作为内源性血管舒张因子的主要成分，能抑制血管壁及循环血中的一些活性因子，从而抑制血管平滑肌细胞增生，防止内皮损伤及动脉硬化形成[13]。晨阳等[4]也发现NO/NOS系统功能低下可能参与了自发性高血压与慢性应激性高血压的发生和发展。本研究观察了高血压和非高血压人群中NO的变化情况，发现高血压患者NO明显低于非高血压者(P<0.01)，说明NO的降低，在高血压发病中也起着非常重要的作用。

　　进一步分析发现：klotho蛋白随着NO的增加而增加，klotho蛋白与NO之间存在着正相关性(r=0.223，P=0.018)。这一结果说明，klotho蛋白的降低可引起NO生成减少，而NO减少，使NO/NOS系统功能低下，会造成了血管收缩和舒张的不平衡，促使动脉粥样硬化的发生，最终导致高血压的发生。提示klotho蛋白可能通过NO机制参与了高血压的发病过程。那么，提高机体klotho蛋白水平能否防止高血压发病或延缓高血压病程，尚有待进一步研究。

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