白藜芦醇对重症急性胰腺炎大鼠脑损伤的保护作用

【摘要】 目的 探讨白藜芦醇对实验性重症急性胰腺炎(SAP) 大鼠脑损伤的的保护作用。方法 96只成年雄性SD大鼠随机分为假手术(SO)组;重症急性胰腺炎(SAP)组;地塞米松(DEX)治疗组和白藜芦醇(RES)治疗组。各组大鼠均于制模后3、6、12h采集标本。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清髓鞘碱性蛋白(MBP)、细胞间紧密连接蛋白(Zo1)、TNFα和IL6含量;透射电镜观察胰腺和脑组织超微结构的变化。结果 SAP组各时间点MBP和Zo1水平均明显高于SO组(P<0.05)，RES组和DEX组MBP和Zo1水平较SAP组明显降低(P<0.05)。RES组和DEX组TNFα、IL6含量均明显低于SAP组(P<0.05)。SAP组出现明显神经元细胞肿胀、毛细血管淤血、血栓形成、线粒体肿胀和细胞凋亡等超微结构的变化，RES组和DEX组上述改变明显减轻。RES组各项指标与DEX组差异不显著(P>0.05)。结论 Zo1的降解参与了大鼠SAP脑损伤的病理过程;MBP可以作为SAP脑损伤程度的判断指标;白藜芦醇可以降低SAP大鼠脑血管上皮损伤程度，从而起到减轻SAP脑损伤的作用。

【关键词】 重症急性胰腺炎;白藜芦醇;脑损伤

　　ABSTRACT: Objective To explore the protective effect of resveratrol on rat brain injury resulting from severe acute pancreatitis (SAP). Methods Ninetysix male SpragueDawley rats were randomly pided into four groups: shamoperation (SO) group， severe acute pancreatitis (SAP) group， resveratroltreated (RES) group and dexamethasonetreated (DEX) group， with eight rats in each group evaluated at 3， 6 and 12h. Levels of serum myelin basic protein (MBP)， tight junction protein zonula occludens 1 (Zo1)， TNFα and IL6 were determined by ELISA. The ultrastructural changes of the brain and pancreatic tissues were examined using a transmission electron microscope. Results MBP， Zo1， TNFα and IL6 levels in RES group were lower than those in SAP group at all time points (P<0.05). RES and DEX groups had a significantly improved brain pathology compared to SAP group， which had ultrastructural changes such as obvious neuron swelling， capillary hemostasis， thrombosis and cell apoptosis. The parameters did not differ significantly between RES and DEX groups (P>0.05). Conclusion The degradation of Zo1 is involved in the pathophysiology of brain injury in SAP; MBP can be used as a marker of brain injury in SAP rats. Resveratrol can inhibit brain injury associated with SAP.

　　KEY WORDS: severe acute pancreatitis (SAP); resveratrol; brain injury

　　重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)发病过程中一旦伴发神经系统并发症，我们就称之为胰性脑病(pancreatic encephalopathy， PE)。至今为止，胰性脑病仍缺乏明确的诊断标准，主要依靠的诊断依据就是在胰腺炎发病过程中出现相应中枢神经系统的症状和体征[1]。而这些症状主要表现为定向力障碍、谵妄、昏迷、反应迟钝、抑郁或者淡漠。病理学检测往往表现为中枢神经系统弥漫脱髓鞘改变[2]。近年来，虽然SAP治愈率已经得到明显改善，但是，SAP患者一旦并发PE，则死亡率仍然高达67%[3]。关于PE的发病机制，目前多数学者倾向于它是SAP过程中多因素作用的结果。

　　我们前期大量的动物实验证实，白藜芦醇(resveratrol， RES)对大鼠重症急性胰腺炎具有较好的治疗作用[47]。本研究的目的是观察白藜芦醇对大鼠脑损伤的保护作用及其作用的可能通路，从而进一步探讨白藜芦醇治疗SAP的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠96只，体重250～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供;牛磺胆酸钠，由美国Sigma公司提供;白藜芦醇，由西安奥塞斯生物有限公司提供;MBP、Zo1、TNFα和IL6 ELISA检测试剂盒，由晶美生物工程有限公司提供;透射电镜由日本东芝公司提供。

　　1.2 实验动物与模型制作方法 96只成年雄性健康SD大鼠，随机分为假手术组(SO)组、胰腺炎模型组(SAP)组、白藜芦醇治疗组(RES)和地塞米松对照(DEX)组，每组分为3、6、12h三个时间点各8只。大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠(1.2mg/kg)腹腔注射麻醉。动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40g/L牛磺胆酸钠(1mL/kg)经胰胆管逆行注射，保持1min后拔出穿刺针，取出动脉夹。SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁。RES组在建立模型后立即经阴茎背静脉注射白藜芦醇10mg/kg。DEX对照组在建立模型后立即经阴茎背静脉注射地塞米松0.5mg/kg。大鼠分别在制模后3、6、12h剖杀取材。

　　1.3 脑组织和胰腺组织的病理学观察 脑组织和胰腺组织使用40g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察胰腺组织的病理学改变。另分别取脑组织和胰腺组织1mm3以25g/L戊二醛4℃固定8h，梯度酒精脱水，环氧树脂Epon812浸透，LKBV型超薄切片机进行超薄切片(50～70nm)，电镜下观察脑和胰腺组织的超微结构的改变。

　　1.5 血浆MBP、Zo1、TNFα和IL6的ELISA检测

　　应用晶美生物工程有限公司提供的ELISA检测试剂盒检测血浆中MBP、Zo1、TNFα(tumor necrosis factoralpha)和IL6(interleukin6)的含量，详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

　　1.6 统计学处理 应用SPSS13.0进行数据分析，组内比较用单因素方差分析，结果用均数±标准差(±s)表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 血浆MBP、Zo1、TNFα和IL6的ELISA检测

　　SAP组各时间点MBP、Zo1、TNFα和IL6含量均明显高于SO组(P<0.05)，RES组和DEX组各时间点MBP、Zo1、TNFα和IL6水平均低于SAP组(P<0.05)，RES组和DEX组之间无明显差异(表1)。表1 各组大鼠12h的MBP、Zo1、TNFα和IL6的检测结果与SO组比较，*P<0.05;与SAP组比较，#P<0.05。

　　2.2 脑和胰腺组织病理学的改变 SO组无明显病理学改变。SAP组肉眼见胰腺片状坏死，胰周及网膜点状皂化斑，大量血性腹水;镜下胰腺实质坏死及炎性细胞浸润均较严重，提示SAP模型复制成功。RES和DEX组胰腺组织病理改变均较SAP组明显减轻。SAP组透射电镜可见到典型细胞凋亡、线粒体肿胀、细胞水肿、毛细血管充血、血栓形成等病理改变。RES和DEX组上述变化明显减轻(图1)。

　　3 讨 论

　　SAP脑损伤的发病机制至今仍不是很清楚。目前，认为它是一个多因素作用的结果，包括胰酶自身激活、炎症因子和氧自由基过渡释放、血流动力学改变和微循环障碍、ET1/NO比例失调、低氧血症、细菌感染、水电解质紊乱和维生素B1等综合性因素[8]。不管导致脑损伤的起始因素是什么，在SAP过程中血脑屏障破坏导致脑血管通透性增加是引起脑损伤的基本环节。

　　Zo1是于1986年首次被报道的细胞间紧密连接蛋白[9]。近年来，学者们发现Zo1不仅构成血管屏障，而且参与了血管内外的物质转运、保持上皮极性、参与细胞分化与增殖、参与肿瘤细胞的转移等重要病理生理过程。它通常被看作是细胞骨架和血管屏障功能的标志物。

　　A：SO组;B：SAP组;C：RES组;D：DEX组。 髓鞘是中枢神经系统特有的组织结构，它主要由有磷脂(70%)和蛋白质(30%)构成。MBP是髓鞘中最主要的蛋白质成分，它主要由神经胶质细胞分泌。血清中MBP水平升高是中枢神经系统受到损伤的重要标志。在许多疾病如多发性硬化症、脑损伤、脑缺氧、脑血管意外等均可以检测到MBP水平升高。

　　我们在成功建立大鼠SAP模型后发现，随着血清中TNFα和IL6水平升高，Zo1水平也相应增高，大鼠脑损伤的程度也逐渐加重。这提示Zo1的降解与脑损伤存在一定相关性。它有可能是血脑屏障功能破坏的早期反应。而且它的降解程度与脑损伤的程度应具有一定的相关性。因此，减轻Zo1的降解，就可以减轻脑损伤的程度。

　　白藜芦醇是从多种植物中提取的有效成分，具有多种生物学活性，主要包括抗炎、抗氧化、改善微循环等作用。我们将白藜芦醇用于急性胰腺炎的前期实验后发现，白藜芦醇具有明显的改善微循环和抑制炎症介质释放的作用。用药后SAP大鼠的存活率提高，血清内NO的含量上升而TNFα、IL6和淀粉酶水平降低，病理变化减轻，表明白藜芦醇能够阻断SAP发病机制的多个环节，从而起到较好的治疗效果。

　　本研究结果表明，白藜芦醇在治疗大鼠SAP过程中具有较明显改善脑损伤程度的作用。降低TNFα和IL6水平、抑制Zo1降解，从而维持血脑屏障完整性可能是其作用机制之一。

参考文献

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