两种注射型载体材料负载骨形态发生蛋白对兔前交叉韧带重建术后腱骨愈合的影响

【摘要】 目的 探讨注射型纤维蛋白胶(FG)、注射型磷酸钙骨水泥(CPC)负载骨形态发生蛋白(bBMP)对前交叉韧带重建术后腱骨愈合的影响。方法 利用新西兰白兔(n=50)双侧趾长伸肌肌腱重建前交叉韧带(ACL)，其中一侧骨隧道与移植肌腱之间的间隙注入复合性材料作为实验组，包括FGbBMP组(n=25)及CPCbBMP组(n=25)，另一侧作为对照组。分别于术后2、6、12周取材，进行MicroCT扫描、组织学染色及生物力学检测观察腱骨之间的愈合状况。结果 影像学结果显示，术后6周，FGbBMP组骨密度BMD值高于CPCbBMP组，但术后12周时，CPCbBMP组腱骨间BMD值最高。组织学结果显示，术后2周，FGbBMP组腱骨间较CPCbBMP组可见更多的软骨细胞及新生骨;术后6周，FGbBMP组腱骨间软骨细胞已逐渐钙化成骨，而CPCbBMP组腱骨界面则呈现新生骨组织向肌腱方向长入;术后12周，CPCbBMP组腱骨间隙被更多的新生骨和新生软骨填充，而FGbBMP组新生骨已明显成熟。对照组术后腱骨间一直被纤维样结缔组织连接。生物力学结果同样证实，FGbBMP组和CPCbBMP组的最大牵拉力均显著高于对照组(P<0.05)。结论 FGbBMP和CPCbBMP复合物均能促进腱骨间的愈合，但FGbBMP组腱骨间新生骨生成具有爆发效应，而CPCbBMP组腱骨间新生骨生成则呈现缓慢上升的趋势。

【关键词】 注射型纤维蛋白胶;注射型磷酸钙骨水泥;骨形态发生蛋白;前交叉韧带重建;腱骨愈合

ABSTRACT: Objective To investigate the effect of two kinds of injected biomaterial combined with bone morphological protein (BMP) on tendontobone healing after anterior cruciate ligament reconstruction (ACL) in rabbits. Methods ACL reconstruction was performed bilaterally in 50 skeletally mature rabbits using long digital extensor tendon grafts. Injected fibrin glue (FG) or injected calcium phosphate cements (CPC) combined with BMP were implanted into the treated knee of each rabbit， with the contralateral knees as controls. Every three rabbits were killed at 2， 6 and 12 weeks postoperatively for routine histological studies. The samples were processed through Micro CT and subsequent HE and toludine blue staining. The remaining 16 rabbits were sacrificed at 6 and 12 weeks. Their femurtendon grafttibia complexes were harvested for subsequent mechanical testing. Results Imageological results showed that 6 weeks after operation， bone mineral density (BMD) values in FGbBMP group were higher than those in CPCbBMP group. However， 12 weeks after operation， BMD values in CPCbBMP group were the highest in the three groups. Histological findings of the interface between the tendon and bone differed in the three groups. Two weeks after operation， more chondrocytelike cells that were fairly disorganized were noted between the tendon and bone in FGbBMP group. Six weeks after operation， mature bone formation around the tendon was observed in FGbBMP group while more immature bone ingrew toward implanted tendon in CPCbBMPgroup; at 12 weeks， more chondrocyte cells and new bone formation were seen in CPCbBMP group while a small quantity of mature bone was around tendon in FGbBMP group. In biomechanical evaluation， the maximum pullout load of the tendon from the bone tunnel was significantly higher in the two treatment groups than in the control group 6 and 12 weeks after operation (P<0.05). Conclusion FGbBMP and CPCbBMP can all augment the tendontobone healing after ACL reconstruction in a rabbit model， but FGbBMP has a burst effect in enhancing the healing， and the CPCbBMP gradually increases the new bone formation during the whole healing process.

　　KEY WORDS: injected fibrin glue; injected calcium phosphate cement; bone morphological protein; anterior cruciate ligament reconstruction; tendontobone healing 伴随手术操作向微创方面发展，可注射型骨移植材料受到关注。此类材料通过注射就可完成植入，降低了手术难度，减少了手术的创伤。本实验选取两种不同的注射型材料复合骨形态发生蛋白(bone morphological protein， BMP)构建注射型生物材料，应用于兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament， ACL)重建手术，在体观察它们对移植肌腱与骨隧道之间愈合的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 注射型纤维蛋白胶(FG)购自广州倍绣生物技术有限公司;注射型磷酸钙骨水泥(CPC)购自上海瑞邦生物材料有限公司;牛骨形态发生蛋白(bovine BMP， bBMP)消毒后的干燥粉末由第四军医大学西京医院全军骨科研究所综合骨库提供。

　　1.2 实验动物及分组 新西兰大白兔50只(第四军医大学动物实验中心提供)，雌性，体重(2.7±0.2)kg。双侧分别行趾长伸肌肌腱重建ACL悬吊固定模型。其中一侧分别行FG、CPC复合材料治疗作为实验组，另一侧不施加任何材料作为对照。实验动物分别于术后2、6、12周处死。

　　1.3 ACL重建动物模型的建立 实验兔使用846复合麻醉剂0.2～0.4mL/kg体重肌注后，仰位固定消毒。切开单侧膝关节和内侧支持带，向外侧脱位髌骨，充分暴露前交叉韧带并完全切除。分离并切取趾长伸肌肌腱，剔除肌性部分后，两端使用不可吸收缝线编织缝后留长约10cm作为牵引线。在胫骨侧，自胫骨隆突向ACL胫骨原止点打一条直径2.5mm的骨隧道;通过该骨道再向上、向外、向后至髁间窝外侧壁后部，靠近股骨原ACL止点向股骨外髁外侧打一条直径相同的骨隧道。用18G针头引导牵引线分别通过胫骨及股骨隧道，先在股骨隧道缝合，反复打结以嵌压于股骨隧道皮质外，于屈膝位30°拉紧，然后自关节腔内的两个骨道口将混合好的复合材料用双腔推注器注入骨隧道与移植肌腱之间的间隙。每个骨隧道注入复合性材料0.5mL(2mg bBMP/0.5mL FG;2mg bBMP/0.5mL CPC)，再在胫骨侧缝合、收紧，在胫骨隧道外口反复打结嵌压于胫骨隧道皮质外。对照组骨隧道内不注射材料。随后逐层关闭切口，消毒。术后不附加外固定，自由笼养。

　　1.4 显微CT(MicroCT)检测 取材标本在行组织学检测之前，置于三维显微CT(eXplore Locus SP，GE，USA)内进行扫描，观察腱骨结合部新生骨组织的骨密度(BMD)(mg/ccm)。扫描条件为largetube_14μm_150min_ss。

　　1.5 组织学检测 术后2、6、12周分别处死实验兔，取胫骨和股骨标本置于100mL/L甲醛缓冲液中固定、脱钙、石蜡包埋，平行于骨髓道方向纵行切片，行HE、甲苯胺蓝染色，光镜下(Leica LA， Germany)观察骨隧道与移植肌腱结合部的交界组织。

　　1.6 生物力学检测 术后6、12周分别处死8只实验兔，于膝关节处离断股骨和胫骨，得到完整的膝关节标本。除保留重建的前交叉韧带外，去除标本上的所有组织连接，将胫骨及股骨端分别固定于AGS型(Shimadzu Corporation， JAPAN)生物力学检测仪特定夹具两端，以50mm/min的垂直拉力进行牵拉试验至肌腱从骨隧道中脱出，此时的牵拉力为腱骨结合面所能承受的最大牵拉力(N)。

　　1.7 统计学分析 使用SPSS11.0统计学软件进行数据处理。所有数据采用平均值±标准差表示，统计方法选用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MicroCT结果 如表1所示，FGbBMP及CPCbBMP均能促进腱骨间骨的生长。术后6周，FGbBMP组和CPCbBMP组的腱骨间BMD均明显高于对照组(P<0.05)，FGbBMP组BMD值虽高于CPCbBMP组，但差异无统计学意义(P>0.05);术后12周，CPCbBMP组腱骨间的BMD值最高，但两个实验组与对照组均无统计学差异(P>0.05)。

　　2.2 组织学结果 如图1、2所示，术后2周，FGbBMP组腱骨间较CPCbBMP组可见更多的软骨细胞及新生骨，肌腱与新生骨之间由疏松组织连接。CPCbBMP组大多数腱骨界面充满CPC残余颗粒及疏松纤维组织，还有新生的骨组织;对照组腱骨界面有明显间隙，二者之间被含有血管的纤维结缔组织填充。表1 3组术后不同时间腱骨间BMD值的比较

　　术后6周，FGbBMP组骨隧道与肌腱结合面间可见大量软骨细胞并逐渐钙化成骨，新生骨组织与软骨细胞混杂;CPCbBMP组腱骨界面被类似于Sharpey样纤维的胶原连接，新生骨组织呈现向肌腱方向长入，新骨形成量明显低于FGbBMP组;对照组腱骨界面仍然被纤维结缔组织填充。

　　术后12周，FGbBMP组腱骨间间隙更为狭窄，二者之间主要被类似于Sharpey样纤维的胶原连接，新生骨组织成熟;CPCbBMP组腱骨间间隙也变得狭窄，被更多的新生骨和新生软骨填充，腱骨间呈连续性新生骨连接，新生骨与肌腱移植物之间仍主要由Sharpey样纤维连接;对照组腱骨间间隙变狭窄，有部分显示Sharpey样纤维连接其中。

　　2.3 生物力学结果 如表2所示，术后6周，FGbBMP及CPCbBMP两组标本的最大牵拉力值均明显大于对照组(P<0.05)，其中CPCbBMP组数值最大;术后12周，FGbBMP及CPCbBMP两组所测值也均大于对照组，但无显著性差异。表2 3组最大牵拉力(N)的测量结果

　　3 讨 论

　　ACL重建手术常采用自体骨髌腱骨(BPTB)和腘绳肌肌腱作为移植物。BPTB由于供区并发症问题使其使用率逐年下降;而自体腘绳肌腱因供区病损小，对伸膝装置无干扰，可取得与BTB重建类似的膝关节稳定效果，目前已成为主流重建方式。但有报道指出，采用腘绳肌腱重建ACL术后约有10%的患者出现关节不稳，主要原因是腱骨愈合不良[1]。因此，移植肌腱与骨隧道及早、可靠地愈合，是ACL重建手术成功的关键。RODEO等[23]研究发现，ACL重建后，腱骨之间最先出现纤维血管组织，随后新生骨开始向肌腱方向长入，且腱骨间生物力学功能的提高与骨长入的程度呈正相关，提示提高腱骨间骨长入是促进腱骨愈合的有力措施。

　　为促进腱骨间新生骨的长入，学者尝试将生物活性因子，如BMP等应用于ACL重建修复领域[45]。BMP是目前已知的最有效的促骨生长因子，可诱导未分化的间充质细胞分化为软骨和骨细胞，但BMP的扩散能力强，易于被组织酶类降解，直接将其植入体内，会迅速弥散、降解而不能充分发挥骨诱导作用。因此，BMP必须有合适的载体材料与之复合，使其植入体内后可持续保持成骨活性[6]。基于近年来关节镜技术的广泛应用，本实验选取了纤维蛋白胶和磷酸钙骨水泥两种临床广泛使用、生物相容性良好的注射性材料作为载体，与BMP体外复合构建注射型骨修复材料，用以促进ACL重建后腱骨间的生物愈合。选取两种载体的基础是利用FG和CPC成形前，在不影响BMP活性的情况下将bBMP粉末与其组成成分通过物理混合形成(半)液性活性因子载体复合系统。然后，将其注射入体内后逐渐固化、快速成型，从而避免了BMP的流失。

　　组织学观察及影像学定量结果显示，FGbBMP与CPCbBMP促进腱骨之间骨生长有明显不同。FGbBMP组在促进腱骨间骨生长过程中存在“爆发”效应，6周时腱骨间被新生骨及多量软骨细胞充满，12周时趋于稳定;而CPCbBMP组腱骨界面整个愈合过程中，新骨生长呈现递增趋势。FG与BMP复合后诱导新骨生成量增加的主要机制，可能是FG较强的粘着力使BMP释放缓慢，在植入区建立一个浓度梯度，延长BMP与靶细胞的接触时间[7]。然而，本实验中FGbBMP组组织学观察及影像学定量检测结果显示，腱骨间成骨量较低，分析主要由于FG在体内降解较快，导致BMP释放过快，使得诱导的靶细胞数量有限[8]。而自固化CPC与BMP复合后的材料由于CPC自身降解缓慢的特点间接延长了BMP与靶细胞作用的时间[910]，从而使成骨效果更持久，无初始“爆发”释放，是BMP良好的缓释载体，但CPC降解较为缓慢的特点也制约了腱骨间新生骨的大量生成，因此其BMP的缓释效率还有待改善。

　　FGbBMP与CPCbBMP两组腱骨间均未形成类似于原ACL正常止点的直接连接，都形成了以Sharpey样纤维为主的胶原连接，即间接连接。然而，它们的生物力学性能都高于对照组，且CPCbBMP组最大牵拉力数值一直较FGbBMP及对照组高。其原因可能为：①CPC降解缓慢使得BMP释放有赖于材料的逐步降解，因而募集到较多的间充质干细胞和成骨细胞前体细胞，间接增加成骨细胞的数量;②腱骨结合部注入CPC，消除了腱骨间的缝隙，使肌腱与骨隧道直径匹配合理，挤压严密，避免“钟摆效应”，防止了骨隧道扩大，也避免关节液浸入骨隧道而影响腱骨间的愈合。而FG作为凝胶，自身降解太快且力学性能较弱，加之关节液内的蛋白酶及炎性细胞因子可能加速其降解，因此CPCbBMP组腱骨间愈合后的生物力学功能在3组中表现最好，为其在临床的应用提供了坚实的实验基础。

　　综上所述，FGbBMP和CPCbBMP复合物均能促进腱骨间的愈合，但二者在体内生物降解率不同，导致FGbBMP组腱骨间新生骨生成具有爆发效应，而CPCbBMP组腱骨间新生骨的生成则呈现缓慢上升的趋势。在后续实验中，我们试图将二者通过不同比例混合，提高CPC的降解率，从而间接提高BMP的缓释效率，促进腱骨间更良好地愈合。

参考文献

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