2型糖尿病患者肠道拟类菌属和双歧杆菌属多样性的PCRDGGE指纹图谱分析

　　　　　　 作者：吴晓康，徐纪茹，张旭燕，

　　　　 马超锋，韩蕾，申艳星，NAWAZ M1，王娟

【摘要】 目的 分析2型糖尿病患者肠道拟类菌属和双歧杆菌属的多样性及其与健康个体的差异，探讨糖尿病与肠道优势菌属的相关性。方法 收集2型糖尿病患者和健康志愿者粪样，提取样品中菌群总DNA，利用拟类菌和双歧杆菌16SrRNA种属特异性引物，进行PCR扩增，将产物用变性梯度凝胶电泳分离，获得肠道菌群分子指纹图谱，进行多样性和相似性等特征分析。结果 糖尿病组和健康人组样品DGGE图谱多样性指数范围分别是：拟类菌属0.89(0.75～0.95)，0.95(0.89～0.97);双歧杆菌属：0.85(0.75～0.94)，0.87(0.73～0.93)。组内成对相似性系数累积曲线分析，拟类菌属：小于0.5的Cs值在糖尿病组占到总Cs值个数的85.83%，而健康人组只占到35.71%;双歧杆菌属：小于0.4的Cs值在糖尿病组占到总Cs值个数的90%，健康人组占到总Cs值个数的60.7%。结论 糖尿病患者和健康人肠道拟类菌属和双歧杆菌属指纹图呈现个体特异性，糖尿病患者两种菌属多样性与健康个体无显著差异，而糖尿病患者个体之间的相似性较健康个体之间低。

【关键词】 2型糖尿病;肠道菌群;变性梯度凝胶电泳;指纹图谱技术;多样性

　　ABSTRACT: Objective To analyze the persity of Bacteroides and Bifidobacterium in type 2 diabetes patients and its difference from that of healthy inpiduals so as to explore the relation between diabetes and gut predominant microbiota. Methods Bacterial DNAs from type 2 diabetes patients and healthy inpiduals were extracted from fecal samples and then characterized by PCRdenaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) with genus and groupspecific primers targeting 16S rRNA for Bacteroides and Bifidobacterium. After DGGE profilings was obtained， the persity and similarity analyses were carried out by the number of band， ShannonWeaver (H)， cluster analysis and the cumulative distribution curve of similarity. Results The range of ShannonWeaver (H) in diabetes group and healthy group was 0.89(0.75-0.95) and 0.95(0.89-0.97) for Bacteroides; 0.85(0.75-0.94) and 0.87(0.73-0.93) for Bifidobacterium. The cumulative distribution curve of intragroup similarity showed thatthe Dice similarity coefficient (Cs) lower than (or equal to) 0.5 took up 85.83% of the total Cs for Bacteroides in diabetes group and 35.71% in healthy group; the Cs lower than (or equal to) 0.4 constituted 90% of the total Cs for Bifidobacterium in diabetes group and 60.7% in healthy group. Conclusion DGGE profiling has shown inpidual specificity in diabetic group and healthy group for Bacteroides and Bifidobacterium. There is no significant distinction in persity of Bacteroides and Bifidobacterium between the two groups. The intragroup similarity of Bacteroides and Bifidobacterium is lower in diabetic group than in healthy group.

　　KEY WORDS: type 2 diabetes; gut microbiota; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); molecular profiling; persity 肠道菌群对维护人体健康具有非常重要的作用。近来，越来越多的数据显示肠道菌群与肥胖症、2型糖尿病等代谢性疾病的发生密切相关，产生了许多新的研究思路和突破性的研究成果[1]，为理解代谢性疾病发生机制和寻找新的治疗靶点提供了重要线索。

　　拟类菌(Bacteroides)和双歧杆菌(Bifidobacterium)属于肠道的优势菌属，其数量和多样性对于维持肠道菌群之间及与宿主之间相互作用的稳定具有重要的作用。研究发现粪便菌群中可培养的细菌拟类菌大约占到30%，B.fragili为主要种型，拟类菌属的结构会在不同个体也表现出不同的特征[23]。CANI等[4]发现双歧杆菌可以改善糖耐量、改善糖诱发胰岛素的分泌，降低毒素血症和血浆脂肪组织的促炎症因子水平，使低浓度炎症好转。目前，调查糖尿病患者肠道拟类菌属、双歧杆菌属结构和多样性特征的研究资料还是很少。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE)技术自MUYZER等[5]第一次用来分析微生物群落，后得到广泛应用。利用细菌16S rRNA基因进行PCR特异性扩增结合DGGE分析已成为研究微生物群落多样性的常规方法，可观察群落结构的动态变化[6]。本研究试图以PCRDGGE指纹图技术分析临床2型糖尿病患者和健康个体肠道菌群，了解2型糖尿病患者肠道优势菌属的结构特征，比较糖尿病患者与健康个体肠道拟类菌属和双歧杆菌属多样性的差异，研究糖尿病对肠道菌群结构的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本收集 从西安交通大学医学院第二附属医院收集2型糖尿病患者的粪便样品。病例筛选标准为：①患2型糖尿病有1年以上病史;②采样前1月内未使用抗生素、益生菌或者益生元等制品;③近1月内无腹泻、痢疾等胃肠道疾病。患者中男性10名、女性6名，年龄范围52～65岁，共计16例(以下简称糖尿病组)。对所有患者一般情况进行调查，包括：年龄、性别、身高、体重、个人健康情况(急、慢性疾病和血糖水平)、生活习惯(体育锻炼、饮食习惯等)。另从社区收集健康志愿者的粪便样品作为对照，选择标准：①身体状况良好;②采样前1月内未使用抗生素、益生菌或者益生元等制品;③近1月内无腹泻、痢疾等胃肠道疾病。健康人中男性4名、女性4名，年龄范围51～65岁，共计8例(以下简称健康人组)。对入选的糖尿病患者和健康个体还要求有相似的饮食习惯，如以谷类(小麦、稻米)、蔬菜和少量肉食为主，遵守糖尿病患者每日的食量控制，禁食糖类食品等。样品的采集得到当地伦理委员会和本人的知情同意。粪样用洁净的样品杯收集后立即冻存在-80℃。

　　1.2 主要实验仪器和试剂 Dcode变性梯度凝胶电泳系统(BioRad，USA)，PCR仪(ABI，USA)，凝胶成像Gel DocTMXR系统(BioRad，USA)。QIAamp粪便DNA提取试剂盒(Cat.no.51504)、Taq DNA聚合酶(Promage)、dNTP、丙烯酰胺(Acr)、N，N亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、去离子甲酰胺、尿素、过硫酸钠、四甲基乙二胺(TEMED)、琼脂糖、DNA Marker、溴化乙锭(EB)等试剂均购自陕西众美生物科技有限公司。实验所用引物合成购自上海生工生物公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 粪便细菌总DNA的提取 将粪便标本放在冰上解冻，使用QIAamp粪便DNA提取试剂盒(QIAGEN，Germany)，操作步骤按试剂盒说明进行。

　　1.3.2 PCR扩增 利用拟类菌和双歧杆菌16SrRNA基因种属特异性引物，进行PCR扩增。拟类菌属特异性引物为：BactF：TCAGTTGTGAAAGTTTGCG，BactR：GCclampaGTRTATCGCMAACAGCGA，扩增产物大小为287bp[3];双歧杆菌属特异性引物为：BifidF：CTCCTGGAAACGGGTGG，BifidR：GCclampaGGTGTTCTTCCCGATATCTACA，扩增产物大小为596bp[7]。每对引物的反向引物5端延伸添加GC夹，有利于产物在DGGE中的分析。PCR反应50μL体系，包括：10×PCR缓冲液5μL，正向引物、反向引物(5μmol/L)各2μL，dNTP(10mmol/L)1μL，MgCl2(2.5mmol/L)5μL，DNA Taq酶(5u/μL)0.4μL，DNA模板4μL，h3O 30.6μL。PCR反应程序如下：预变性95℃ 5min;变性 95℃ 1min，退火55℃和60℃ 1min，延伸 72℃ 1min，30个循环。最终延伸72℃ 7min，4℃保存。PCR产物用NanoPhotometerTM (IMPLEN，Germany)微量核酸/蛋白检测仪测定含量。取10μL PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳检测，电泳的电压为6V/cm，采用溴化乙锭(EB)染色20min，后在成像分析系统拍照。

　　1.3.3 DGGE的分析 应用DCode TM Universal Mutation检测系统(BioRad， Hercules， CA， USA)，胶板大小为16cm×10cm×1cm。实验中，不同引物扩增的产物应选择不同变性梯度范围。通过制作0%～100%变性聚丙烯凝胶，来摸索变性梯度范围。预试验已获得拟类菌属和双歧杆菌属扩增产物DGGE分析的变性梯度范围(表1)。

　　按照仪器使用说明，将凝胶装置在电泳系统中，使用新配制的1×TAE电泳缓冲液，以150V电压预电泳30min，然后取10μL PCR产物与6×上样缓冲液混匀加入到上样孔中，安装好电泳系统后即开始电泳：先以60V电压电泳1h，后以100V电压电泳12h，电泳温度设定为60℃。电泳完毕后，将胶小心的放入EB溶液(0.5mg/L)中染色20min，用凝胶成像系统360nm波长的紫外线激发，获得凝胶上条带图像，并拍照保存。比较不同DGGE凝胶图像时，采用DNA Marker(DL2000)条带作为标准，使用BioNumerics2.5(Applied Maths， St.MartensLatem， Belgium)进行图像匹配。两块胶板在同次实验中进行，减少实验误差[3]。表1 DGGE分析的实验条件

　　1.3.4 DGGE指纹图的分析 糖尿病患者和健康人样本肠道菌群的指纹图分析利用Quantity One软件(BioRad， USA)采集图中条带数目、灰度值，然后用ShannonWeaver(H)指数来分析糖尿病患者和健康人肠道菌群细菌类型的多样性[89]。其公式为H=∑pi lnpi， (pi=ni/N)，其中ni为单个条带的亮度，N为所有条带的亮度。相似性系数和聚类分析基于Dice相似性系数的UPGMA方法，绘制相似性系数累积分布曲线图分析组内个体相似性[10]。

　　1.4 统计学处理 所得数据应用SPSS13.0软件处理，计量资料结果经正态性检验，服从正态分布的资料均以±s表示，用独立样本的t检验;若不服从正态分布，以中位数(四分位数间距P25～P75)表示，用非参数U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 糖尿病患者与健康人的拟类菌属的DGGE分析 指纹图谱上条带的数量、电泳位置和灰度值在每个样本泳道中呈现不同，显示了肠道菌群复杂的指纹图谱和个体特异性。多数样本可观察到有3～7条灰度较强条带，不同样本之间大致有3条相同位置的条带(图1A)。

　　为分析糖尿病组和健康人组拟类菌属的多样性，采用计数图谱中条带数和计算ShannonWeaver(H)指数(表2)。结果可以看出，糖尿病组拟类菌属条带数和H指数与健康人组比较无显著性差异，提示糖尿病未明显影响到拟类菌属的多样性。两组组内相似性及条带聚类分析(图1B)可以看出，糖尿病组内个体间平均相似系数为(37.3±15.6)%，而健康人组组内平均相似性系数为(59.7±17.3)%，两组比较有显著性差异(P<0.05)。计算并绘制了两组个体之间的成对相似系数的累积分布曲线，曲线反映的是相似性系数的分布特征，靠近Y轴的曲线表明有更多的相似性系数分布在低数值区[10]，即更多的个体相互之间差异较大，相似性较低。对两组拟类菌属分析可以看到(图2)，小于0.5的Cs值在糖尿病组占到总Cs值个数的85.83%，而健康人组只占到35.71%，两组比较有显著性差异(P<0.05)。这个结果提示健康人组个体之间拟类菌属结构更趋于相似，而糖尿病组个体更趋于不同，糖尿病影响个体之间拟类菌属的相似性。表2 糖尿病组和健康人组拟类菌属、双歧杆菌属多样性和相似性

　　2.2 糖尿病患者与健康人的双歧杆菌属的DGGE分析 特异性引物扩增双歧杆菌属进行DGGE图谱分析(图3A)，可以看到样本间带型变化较大，共同条带相对拟类菌属较少。糖尿病组和健康人组双歧杆菌属多样性分析依据条带数和灰度值计算其ShannonWeaver(H)指数表明无显著性差异(表2)。两组组内相似性及条带聚类分析可以看出(图3B)，糖尿病组内个体之间平均相似系数为(24.6±14.1)%，健康人组为(34.2±20.4)%，糖尿病患者之间相似性度降低，差异增大(P<0.05)。从相似性系数累积分布曲线也可以看出(图4)，糖尿病组小于0.4的Cs值占到总Cs值个数的90%，健康人组小于0.4的Cs值占到总Cs值个数的60.71%，二组比较有显著性差异(P<0.05)。这一结果表明糖尿病组个体间相似性较健康个体低，糖尿病患者之间相似程度更趋不同。

　　3 讨 论

　　近来，2型糖尿病等代谢性疾病的发生与肠道菌群的相关性研究取得了很多进展。该方面研究假说认为在饮食因素诱导下，致使肠道菌群结构发生改变，产生“不良”的代谢产物进入机体引起“代谢性内毒素血症”，引发机体炎症反应和胰岛素抵抗等[11]。但是，到底肠道菌群中哪些种细菌在疾病的发生中起到关键作用，肠道菌群的结构等生态学特征的变化是造成疾病发生的起因，还是疾病发生后表现出来的结果，这些问题目前还无法得到解释。而随着研究的深入，关于肠道菌群与疾病的相互作用关系将会被逐步揭示。

　　本研究主要采用非培养的分子生态学方法了解糖尿病患者肠道优势菌属拟类菌属和双歧杆菌属的多样性和相似性特征，用16SrRNA基因种属特异性引物扩增两种菌属，结合DGGE指纹图技术及分析方法观察2型糖尿病情况下，肠道优势菌属的结构是否发生变化。

　　研究中首要考虑的问题是样本的采集，由于肠道菌群容易受到很多因素的影响，包括生理因素，如年龄、性别、饮食、种族和遗传等，病理因素可因肠道疾病如腹泻、痢疾、肠梗阻等影响到菌群的肠道微环境，进而改变肠道菌群的组成和结构。此外，以临床患者为研究对象，某些影响因素很难控制。因此，我们制定同年龄段、饮食结构相似、同地区人群等标准选样，尽量减少其他因素对实验结果的影响。

　　实验中利用DGGE方法分析了糖尿病患者肠道拟类菌属和双歧杆菌属的多样性和相似性，并与健康人组进行了比较，尽管个别样本两种菌属图谱条带数和ShannonWeaver(H’)指数较低，其多样性下降，但是统计学分析两组无显著性差异，说明糖尿病对肠道两种菌属多样性影响不显著。这可能是由于糖尿病与肠道菌群平衡整体变化相关，而并非与单一一种细菌或微生物的多样性变化相关。另外，从临床观察来看，糖尿病患者多为中老年性患者，常有便秘的情况，这可造成肠道蠕动减慢、细菌过度的增长，而不会出现像菌群失调那样大幅度菌群多样性的改变。

　　实验中也分析了糖尿病组和健康人组内个体之间菌属的相似程度，试图了解两组肠道菌群结构自身的特点。通过比较Dice相似性系数可以看到糖尿病个体之间相似度低，个体间菌群差异较大。我们计算并绘制了两组内个体之间的成对相似性系数累积分布曲线图，可以更加明显看到健康个体之间菌群结构趋于相似，而糖尿病组个体之间菌群差别较大。这表明了2型糖尿病影响到两种优势菌属结构的稳定性，细菌属内的种型及数量发生改变，提示糖尿病患者两种菌属结构有所变化。

　　本实验用DGGE技术从分子水平对糖尿病患者肠道拟类菌属和双歧杆菌属结构特征进行了初步研究，为了解糖尿病与肠道优势菌属的相关性研究提供了资料。

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