不同衰老大鼠模型大脑皮层细胞凋亡状况的比较

　　 作者：高会丽 王丹巧 汪晓燕 王志国 王香明 吴兆恩 刘红 马琰岩 牛晓红 李连达

【摘要】 目的 比较不同方法建立的衰老大鼠模型大脑皮层细胞凋亡与线粒体膜电位的变化状况。方法 实验分为正常对照组、单纯腹腔注射D半乳糖组、单纯摘除胸腺组、D半乳糖注射联合胸腺摘除组、维生素E、C治疗组。造模及投药6 w后，检测血清超氧化物歧化酶(SOD)水平和血清总抗氧化能力(TAOC)，并采用流式细胞术观察大脑皮层神经元细胞凋亡发生率以及神经元线粒体膜电位。结果 造模及投药6 w后，与对照组比较，3个造模组血清SOD水平和TAOC均明显下降(P&<0.05)，造模3组之间无显著差异;神经元细胞凋亡发生率均明显上升，神经细胞线粒体膜电位均显著降低(P&<0.05)，以D半乳糖腹腔注射联合胸腺摘除组尤为明显，与单一方法造模的两组比较该两项指标变化均有显著意义(P&<0.05)。结论 应用胸腺摘除复合D半乳糖腹腔注射方法建立的衰老大鼠模型，更能体现出神经细胞衰老损伤的病理特征。

【关键词】 D半乳糖;摘除胸腺;神经细胞凋亡;线粒体膜电位;衰老模型

　　【Abstract】 Objective To compare the characteristic of apoptosis and mitochondria membrane potential of cerebral cortex cells in aging rats induced by different methods. Methods The aging rats models were established only by peritoneal injection D–gal， only thymus gland removal and peritoneal injection D –gal combined thymus gland removal respectively. The treatment group rats were intragastric administrated with vitamin E.C. After six weeks， the serum activities of SOD and TAOC were detected. The cerebral cortex neuronal apoptosis proportion and mitochondrial membrane potential were measured by means of chromatometry and flow cytometry. Results After six weeks， compared with those of the normal control group， the serum levels of SOD and TAOC in three different model groups were decreased significantly(P&<0.05)，while there were no obvious difference between the three groups. Meanwhile， the proportion of neuronal apoptosis was increased remarkably and mitochondria membrane potential of neuronal cells were reduced notably in the three model groups (P&<0.05). Especially， there was statistic difference in the model group induced by peritoneal injection Dgal combined thymus gland removal compared with the other model groups(P&<0.05). Conclusions The aging rats models induced by peritoneal injection Dgal combined thymus gland removal manifeste pathological characteristics of aging better.

　　【Key words】 Dgalactose; Thymus gland removal; Nerve cells apoptosis; Mitochondria membrane potential; Aging model

　　 大脑皮层神经元的衰老被认为是整体衰老过程中的重要特征之一，而神经元的细胞凋亡又是脑衰老的具体表现。用于衰老实验研究的动物模型多种多样，除遗传背景及机制明确的转基因模型外，D半乳糖、γ射线辐照、胸腺摘除、臭氧损伤等衰老大鼠模型等也常被选用。本实验根据衰老过程中氧化应激与免疫功能下降的机制，采用腹腔注射D半乳糖复合胸腺摘除的方法造成衰老大鼠模型，并比较单一造模方法对大脑皮层神经细胞凋亡、线粒体膜电位以及机体抗氧化能力的影响，为延缓衰老特别是延缓神经系统衰老的药物筛选及作用机制研究提供可用的模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 SD大鼠，50只，雄性，体重250～300 g，SPF级，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供，合格证号：SCXK(京)20050004。

　　1.2 药物与仪器 维生素E、C颗粒，购自北京双鹤药业股份有限公司，国药准字H11022348，每袋含维生素E 0.1 g，维生素C 0.2 g。D半乳糖(Sigma)。血清超氧化物歧化酶(SOD)和血清总抗氧化能力(TAOC)测定试剂盒(南京建成生物研究所)。凋亡检测试剂(Annexin VFITC)，碘化乙啶(PI)凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)。罗丹明123(Sigma)。荧光活化细胞分类计(FACS AriaTM)、流式细胞仪(美国BD公司)、BSA223SCW 1/1 000电子天平(德国sartorius)、DKS24型电热恒温水浴箱(上海森信实验仪器有限公司)。

　　1.3 胸腺摘除方法 雄性SD大鼠适应性喂养3 d后，3.5%水合氯醛(1 ml/100 g体重)麻醉，沿颈中线剪开皮肤及皮下组织，分开气管前肌并暴露气管。于胸骨上窝沿胸骨柄中点向下剪开胸骨约1.3 cm，暴露胸腺上极，用显微镊牵引并以湿棉签迅速分离，完整取出胸腺两叶，立即用止血钳夹紧、关闭胸腔，待大鼠呼吸平稳后，手术部位投予青霉素粉末，缝合大鼠肌层和皮肤。

　　1.4 动物分组及给药 实验动物按体重随机分为正常对照组，单纯腹腔注射D半乳糖组，单纯摘除胸腺组，腹腔注射D半乳糖联合胸腺摘除组(复合衰老模型组)，维生素E、C治疗组(阳性药组)。10只/组，常规饲料喂养。阳性药组采用腹腔注射D半乳糖联合胸腺摘除造模法。单纯腹腔注射D半乳糖组大鼠每日腹腔注射20% D半乳糖 400 mg/kg，连续注射6 w。单纯摘除胸腺组大鼠在摘除胸腺后不进行D半乳糖腹腔注射。复合衰老模型组大鼠行摘除胸腺手术1 w后，与阳性药对照组大鼠每日腹腔注射20% D半乳糖 200 mg/kg，连续注射6 w。阳性药对照组同时给予维生素E、C 0.054 g·kg-1·d-1灌胃给药，给药6 w。正常对照组、单纯腹腔注射D半乳糖组、单纯摘除胸腺组、复合衰老模型组每日灌胃等量蒸馏水。

　　1.5 观察指标及检测方法

　　1.5.1 血清SOD和TAOC测定 腹主动脉取全血5 ml，室温下静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取上清分装于1.5 ml EP管中，-70℃冰箱保存待用。SOD、TAOC指标的测定均按照试剂盒说明书进行。

　　1.5.2 大脑皮层神经元凋亡与线粒体膜电位测定 分离大脑皮层，取右侧额叶部位1/4皮层，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2～7.4)冲洗。在50 ml的试管中用眼科剪将皮质反复剪切成碎块，加入0.125%胰蛋白酶1～3 ml，37℃水浴中消化10～15 min。消化后反复吹打，形成细胞悬液，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM终止消化，过200目细胞筛。轻微吹打形成细胞悬液后，吸取0.5 ml，加入等体积PBS，4℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，反复进行3次。加入1 ml PBS吹打混悬细胞，分装于2个1.5 ml EP管中，0.5 ml/EP管，分别标记为1号和2号。1号管4℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.2 ml结合液后，加入10 μl AnnexinV和5 μl PI，再加入0.3 ml Binding Buffer，过300目尼龙网，流式细胞仪测荧光标记。2号管4℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入罗丹明123染液(终浓度为5 μmol/L)，振荡混匀，37℃避光孵育25 min后4℃，1 000 r/min离心5 min，反复进行2次，去除未结合的染料。最后一次细胞沉淀用0.01 mol/L PBS配成0.5 ml细胞悬液，过300目尼龙网，上流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。

　　1.6 统计学分析 实验数据用SPSS13.0软件分析，以x±s表示，多组间均数比较采用Oneway ANOVA，各组均数间多重比较采用Turkey法，同一组不同处理因素的均数比较采用配对样本t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠血清SOD活力与TAOC的变化 正常对照组、阳性药组与复合衰老模型组血清SOD活力比较具有明显的统计学意义(P&<0.05)，同时正常对照组、阳性药组与单纯D半乳糖注射组和单纯摘除胸腺组比较也有明显的统计学意义(P&<0.05)，其他各组之间的比较则无明显的统计学意义(P&>0.05)。在各组动物血清TAOC的比较中，阳性药组和正常对照组与复合衰老模型组比较明显升高，具有统计学意义(P&<0.05);同时阳性药组与单纯摘除胸腺组相比较也有一定程度的升高，具有明显的统计学意义(P&<0.05);而其他各组之间的比较则无明显的统计学意义(P&>0.05)。见表1。表1 各组大鼠血清SOD活力与TAOC的变化比较(x±s)与复合衰老模型组比较：1)P&<0.05;下表同

　　2.2 各组大鼠大脑皮层神经元凋亡发生率的变化 正常对照组、阳性药组、单纯D半乳糖注射组和单纯摘除胸腺组神经元细胞凋亡的发生率下降分别为〔(5.12±2.25)%，(4.57±2.16)，(7.27±2.06)%，(12.85±11.52)%〕，与复合衰老模型组〔(41.17±9.73)%〕比较，具有显著差异(P&<0.05)，见图1。

　　2.3 各组大鼠大脑皮层神经元线粒体膜电位的变化 正常对照组、单纯D半乳糖注射组、单纯摘除胸腺组、阳性药组大鼠大脑皮层神经元线粒体膜电位分别为(16.81±5.91，20.01±5.19，20.19±1.05，24.39±8.45)与复合衰老模型组(10.18±1.60)比较，均有不同程度的升高，有显著差异(P&<0.05)。

　　3 讨 论

　　现代医学在衰老机制研究方面主要有代谢学说、自由基学说、交联学说、生物膜损伤学说、遗传程序学说、差错学说、染色体突变学说等。研究认为大鼠长期注射D半乳糖产生的自由基损伤和免疫指标的变化与人体衰老指标改变规律基本一致〔1，2〕，因此，该方法也是目前最常用的制备亚急性衰老动物模型的方法。衰老的代谢学说认为，新陈代谢是生命的本质，也是生命活动的基础，衰老是机体代谢障碍的结果。在一定时间内，连续注射大剂量的D半乳糖，会使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇。因其不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍，代谢紊乱，破坏并消耗机体抗氧化防御系统，使自由基积聚，引起氧化应激损伤，出现衰老〔3〕。同时衰老的免疫学说认为，衰老时免疫系统出现结构改变和功能下降，对感染和应激的抵抗能力减弱〔4〕。老年人的免疫器官明显退化，其中以胸腺的改变最为明显。研究认为胸腺是兼备免疫功能和内分泌功能的双重器官〔5〕，在神经内分泌免疫调节网络中起着承上启下、联接神经内分泌系统与免疫系统的功能。大鼠胸腺切除后细胞免疫功能低下，并可引起肝脏脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)增高以及糖代谢异常〔6，7〕，引起类似于人体衰老后各器官的退行性病理变化，因此摘除胸腺可作为一种衰老模型的造模方法。

　　本研究以衰老氧化损伤和免疫功能下降机制为基本理论依据，采用了D半乳糖腹腔注射复合胸腺切除的方法建立大鼠衰老模型。结果显示该模型与单纯胸腺切除、单纯D半乳糖注射模型，均引起血清SOD和TAOC显著下降，但组间无统计学差异;提示在3种引起衰老的模型方法之间动物体氧化应激能力的变化不明显;而对神经元细胞凋亡发生率和神经细胞线粒体膜电位的影响，采用摘除胸腺与D半乳糖腹腔注射建立的复合衰老模型组最为明显，与单一方法造模的其他两组比较其变化具有显著意义。由此体现出复合造模法更能体现衰老过程中神经细胞损伤的病理特点。

　　正常情况下线粒体内膜上生物呼吸链的发生使内膜两侧质子不均匀分布而产生质子梯度，从而形成线粒体膜内负外正的电位差即为Δψm。像细胞膜电位一样，Δψm是维护线粒体内外物质平衡，保持线粒体功能正常活动所必需的。线粒体跨膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体崩溃，则细胞凋亡不可逆转。由此可以看出在衰老过程中如果能减少线粒体膜电位就可在一定程度上预防或者减轻衰老过程中神经元凋亡的发生。本实验中复合衰老模型组对神经元细胞凋亡发生率和神经细胞线粒体膜电位影响的结果提示该模型较以往单一方法制造的模型更容易成功，可以较敏感地反映脑衰老过程中神经细胞损伤早期事件，对神经细胞凋亡始动因素的分析有意义。而且该模型死亡率较低(&<5%)，重复性良好，较单一造模方法而言，有可能缩短造模时间，为延缓衰老的实验研究提供方便。抗氧化剂VitE、C干预后表现出一定程度的可逆转性，因此是延缓神经系统衰老药物筛选及作用机制研究的可用模型。

参考文献

　1 裴凌鹏，常 铮，金宗濂.葛根黄酮改善小鼠抗氧化功能的研究〔J〕.营养学报，2004;26(6):5056.

　　2 崔 旭，李文彬，张炳烈，等.D半乳糖脑老化模型的脂质过氧化机理〔J〕.中国老年学杂志，1998;18(1):3840.

　　3 陈 勤.抗衰老研究实验方法〔M〕.北京：中国医药科技出版社，1996：467.

　　4 Straub RH，Cutolo M，Zietz B，et al.The process of aging changes the interplay of the immune， endocrine and nervous systems〔J〕.Mech Ageing Dev，2001;122(14)：1591611.

　　5 Haddenj W.Thymic endocrinology〔J〕.Int J Immunopharmacol，1992;14(3):34552.

　　6 周金黄，邢善田.中药免疫药理学〔M〕.北京:人民军医出版社，1993:95108.

　　7 张汝学，周金黄，张永祥，等.去胸腺对大鼠糖代谢的影响及地黄寡糖对其的调节作用〔J〕.中国药理学通报，2002;18(2):1947