血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌A549细胞株侵袭力的影响

　　　　作者：彭传亮 丛波 田辉 孙启峰 赵小刚 贠灿华

【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子C(VEGFC)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide ，ASODN)对人肺癌细胞株A549 体外侵袭力的影响。方法 应用脂质体介导的VEGFC正义、反义寡核苷酸转染人肺癌细胞株A549细胞，并设对照组，检测癌细胞的侵袭力变化。结果 经VEGFC ASODN转染的A549细胞株黏附能力显著降低(P&<0.01)，对重组基底膜体外侵袭能力明显减弱(P&<0.01)。结论 VEGFC ASODN能够明显抑制肺癌细胞株A549体外侵袭力。

【关键词】 血管内皮生长因子C;反义;寡核苷酸;A549细胞;肺癌;侵袭力

肺癌是我国目前最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升，尽管以手术为主的综合治疗取得较大进步，但其预后仍不尽人意，有必要尝试寻找治疗肺癌的新途径。经淋巴管转移是肺癌重要的转移途径，血管内皮生长因子C(VEGFC)作为血管内皮生长因子家族成员之一，在癌周组织存在一定程度的表达，并具有促进肿瘤细胞生长、促进血管生成的作用〔1〕，因此能够成为肺癌基因治疗的极好靶点。目前关于肺癌VEGFC靶向治疗的研究较少〔2〕，本研究采用VEGFC反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide，ASODN)转染肺癌细胞株A549，探讨其对肺癌细胞侵袭能力的影响，为肺癌的基因治疗提供有意义的理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 肺癌细胞株来源 人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所，将其接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基，置37℃、5%CO2培养箱中常规培养至80%后备用。

　　1.1.2 主要试剂 寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotide，SODN)、ASODN由上海生物工程公司合成并硫代磷酸化修饰;阳离子脂质体LipofectamineTM2000(LIP)为美国Invitrogen公司产品;RPMI1640(含L谷氨酰胺)培养液为Gibco BRL公司产品;Matrigel、Transwell小室为美国BD公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 LIPSODN转染复合物和预处理 寡核苷酸序列采用硫代硫酸型，ASODN序列为：5′AAGAA GCCCA GCAAG　TGCAT3′;SODN序列为： 5′ATGCA CTTGC TGGGC TTCTT3′，部分寡核苷酸有荧光标记。按 Invitrogen公司LipofectamineTM2000说明书，寡核苷酸(μg)∶LIP(μl)=1∶2.5比例混合配制。根据转染复合物的类别分为4组：空白对照组;LIP组(LIP转染);SODN组(SODN转染);ASODN组(ASODN转染)，终浓度1 333 ng/ml，荧光显微镜下观察转染30 min细胞内便有荧光标记的寡核苷酸出现，随着时间的延长，细胞内的荧光越来越强，转染6～12 h细胞内的荧光最强，转染率70%左右。转染48 h后收集细胞进行检测。

　　1.2.2 黏附实验 将96孔板用Matrigel 5 μg包被，2%BSA封板处理。每孔加入5×104个不同预处理肺癌细胞，置37℃、5%CO2培养箱培养，分别于30、60、90、120 min各时间点弃去培养液，PBS冲洗除去未黏附的细胞。每孔加MTT 20 μl，以及无血清RPMI1640 200 μl，CO2培养箱孵育4 h;吸弃上清液，加DMSO 200 μl振荡10 min后，自动酶标仪570 nm测各孔吸光度(A570)值，计算细胞黏附率。每组设6个复孔，重复3次。细胞黏附率=(实验组A570值/对照组A570值)×100%。

　　1.2.3 侵袭实验 将基质胶按40 μl/孔均匀地铺在侵袭小室聚碳酯膜上，成胶30 min后，置紫外灯下照射过夜，实验前30 min再次成胶。取不同预处理细胞各104个(RPMI1640液200 μl)分别接种到成胶的侵袭小室上，在24孔板内加入NIH/3T3细胞上清液(趋化因子)，每孔600 μl，37℃，5%CO2培养24 h后取出侵袭小室，用棉签头擦掉基质胶，PBS液洗3次，95%乙醇固定15 min，HE染色，揭下侵袭小室聚碳酯膜反贴在载玻片上。结果判定：400倍光镜下随机计数5个视野的穿膜细胞数，取均值。实验重复3次。

　　1.3 统计学方法 数据以x±s表示，采用SPSS12.0软件进行方差分析和q检验。

　　2 结 果

　　2.1 VEGFC ASODN对肺癌细胞黏附能力的影响 随着时间的延长，各处理组细胞黏附能力均增加;同一时间点ASODN组

　　细胞黏附率较其他三组明显降低(P&<0.01)，空白对照组、LIF组和SODN组之间差异不显著(P&>0.05)，见表1。表1 MTT法检测处理后各组细胞不同时间的黏附率(x±s)

　　2.2 VEGFC ASODN对肺癌细胞侵袭能力的影响 与空白对照组、LIF组和SODN组(132.5±15.6;129.7±16.1和118.2±12.5)相比，ASODN组48 h浸润细胞数明显减少(58.6±9.2)(P&<0.01)，对重组基底膜体外侵袭能力明显减弱，见图1。图1 各处理组对肺癌细胞体外侵袭能力的影响(HE，×400)

　　3 讨 论

　　VEGFC作为血管内皮生长因子家族的成员，具有淋巴管内皮细胞增殖和趋化的特异性诱导因子，目前已经成为研究的热点，其高表达被认为可促进淋巴管生成，并与肿瘤细胞向区域淋巴结转移相关。VEGF C经过旁分泌方式分泌后与其受体VEGFR2和VEGFR3结合，使受体磷酸化，通过胞浆内信息传递增加有丝分裂活动，导致内皮细胞增殖和新生淋巴管的形成〔3〕。国内外文献已经报道许多恶性肿瘤如甲状腺癌、前列腺癌、大肠癌、胃癌的VEGFC表达与区域淋巴结转移显著相关，能够增加肿瘤细胞的侵袭能力〔4～7〕。VEGFC在包括肺癌的多种恶性肿瘤中表达较正常组织高，是独立的预后不良因素〔8～11〕。VEGFC高表达的肺癌细胞，有利于癌周微淋巴管的形成，淋巴管增多和淋巴管占据的面积增大，使癌细胞有更多的机会与淋巴管直接接触，大大提高了肺癌细胞的黏附能力和侵袭能力，促进肺癌的经淋巴道转移。因此，从理论上讲，下调VEGFC基因的表达，就能够降低肺癌细胞的黏附侵袭力。

　　利用ASODN进行肿瘤基因治疗是目前生物治疗的主要方法之一，是一种应用ASODN药物来抑制特定基因的表达，有着很好的安全性和有效性，其原理是ASODN能与细胞内某一特定的基因核苷酸序列互补，与细胞内DNA模板、mRNA模板以碱基配对方式结合，可激活细胞内核糖核酸酶，将其消化破坏，还可通过空间位阻效应干扰mRNA代谢过程中加帽、剪接、翻译起始、延长等步骤，干扰目的基因的复制、转录和翻译等过程，达到抑制其生物学功能的目的。肺癌的转移过程也是癌周微淋巴管的形成过程，当肿瘤大于1～2 mm时，则必须要有新生血管的形成，在这些过程中，需要多种因素的参与，其中VEGFC是最重要的因素，尽管VEGFC在很多不同的细胞中表达，但其受体却只表达在血管内皮细胞，因此肺癌细胞中高表达的VEGFC可促进微血管和微淋巴管的形成，提高肿瘤细胞的侵袭能力〔12〕，抑制VEGFC基因的表达可抑制肿瘤的生长和转移。本实验采取VEGFC ASODN干扰技术，针对人VEGFC基因编码起始区合成反义寡核苷酸，通过脂质体介导的VEGFC ASODN转染人肺癌细胞株A549，观察VEGFC ASODN对肺癌细胞的胞外基质黏附和侵袭能力的影响。研究结果表明，VEGFC ASODN能显著降低肺癌细胞的胞外黏附能力，在不同时段ASODN组细胞黏附率明显低于其他三组，有显著统计学差异，48 h浸润细胞数目明显减少，对重组基底膜体外侵袭能力明显减弱，对肺癌的侵袭起负性调控作用。

　　通过VEGFC ASODN对人肺癌细胞A549转染，体外应用ASODN能够特异性封闭VEGFC的表达，侵袭能力的减弱或废除能在相当程度上阻断肿瘤的转移，因此利用反义核酸技术的高度特异性开展针对VEGFC的靶向治疗，将可能为肺癌的基因治疗开辟新的途径。但目前的研究仍仅仅停留在体外实验，还不能应用于临床工作，其确切机制和技术难题仍需要进一步研究。

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