促血管生成素2在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达及其临床意义

【摘要】 目的 探讨促血管生成素2(Angiopoietin2，Ang2)在宫颈癌进展中的作用。方法 采集50例宫颈鳞癌(Ⅰa～Ⅱa期)(SCC)及50例宫颈上皮内瘤变(CIN)标本，并以45例正常宫颈组织作为对照组;应用免疫组化法检测Ang2在上述三组中的表达;检测CD34的表达，计数各组微血管密度(MVD)。结果 (1)Ang2在SCC中的阳性表达率79.6%，在CIN组织中的阳性表达率26.7%，对照组的表达率7.5%。SCC组Ang2的阳性率显著高于CIN组及对照组，CIN组阳性率显著高于对照组(P&<0.05)。(2)SCC组MVD值显著高于CIN组及对照组，差异具有统计学意义(P&<0.05)。(3)SCC组织中，随分化程度的降低，Ang2表达的阳性率显著增高，差异具有统计学意义(P&<0.05)。(4)SCC及CIN组织中，MVD值与Ang2的表达强度呈显著正相关(r分别为0.61、0.52)。结论 Ang2与的血管生成密切相关，参与了肿瘤的恶性生物学行为。

【关键词】 促血管生成素2;微血管密度;宫颈鳞癌;宫颈上皮内瘤变

在体内，肿瘤性的血管生成受到多种血管生成因子的调控。促血管生成素2(Ang2)是在血管生成过程中起重要作用的蛋白质〔1〕，主要作用是促进血管重构，在肿瘤血管新生过程中作用显著。本研究应用免疫组化SP法检测宫颈鳞癌(SCC)、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织中Ang2的表达，同时定量检测微血管密度(MVD)，观察SCC及CIN组织中Ang2的表达及其与临床病理特征的关系，为临床上宫颈癌的抗肿瘤血管生成治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 随机选取2007年1月至2009年1月本院病理科经手术切除及活检存档的蜡块。SCC 50例，CIN 50例(其中CINⅠ20例，CINⅡ17例，CINⅢ13例);取45例正常宫颈组织为对照组。收集SCC患者的临床病理资料，包括：①年龄28～66岁，平均(42±14)岁;②病理分级：高分化25例、中分化15例、低分化10例;③采用国际妇产科联盟(FIGO)分期标准：I期32例，II期18例;④有无淋巴结转移：无淋巴结转移38例，有淋巴结转移12例(所有病例术前均未行任何治疗)。

　　1.2 主要试剂 SABC试剂盒、浓缩型兔抗人Ang2多克隆抗体购于武汉博士德公司。鼠抗人CD34多克隆抗体购于北京中山生物技术公司。

　　1.3 方法 采用SABC免疫组化方法检测Ang2及CD34蛋白的表达。石蜡标本制成4 μm切片常规脱蜡、水化，3% h3O2甲醇液阻断内源性过氧化酶，煮沸修复抗原，正常山羊血清封闭液，一抗(浓缩型兔抗人Ang2，鼠抗人CD34)4℃冰箱过夜，生物素化山羊抗兔IgG抗体，置入37℃温箱孵育20 min，链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，同样置入37℃温箱孵育20 min，使用DAB显色试剂盒，室温下显色，镜下控制反应时间，一般2～6 min，以蒸馏水终止反应;苏木素复染，分化，脱水，透明，封片，显微镜下观察。所有操作按试剂盒说明进行。

　　1.4 结果判定

　　1.4.1 Ang2表达的测定 凡细胞质有棕黄或棕褐色颗粒沉着计数为Ang2阳性细胞，根据染色的程度及染色细胞的百分率进行评分。基本不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘，为其最后得分。0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性()，6分以上为强阳性()。

　　1.4.2 CD34标记的MVD计数 ① CD34蛋白表达阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准;②微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数。只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。肿瘤内硬化区及与肿瘤交界处软组织内的微血管，若有较厚的平滑肌及管腔直径大于8个红细胞的微血管除外;③随机选取5个高倍镜视野(40×10)，分别计数微血管数，取其平均值。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行处理，数据以x±s表示。计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，等级相关采用Spearman等级相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 Ang2在CIN和SCC中的表达 Ang2主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒(见图1)。Ang2在对照组、CIN及SCC中的阳性率分别为7.5%、26.7%、69.6%，SCC组Ang2的表达高于CIN组及对照组(P&<0.05);CIN组Ang2的表达亦高于对照组(P&<0.05)。

　　2.2 CIN和SCC中的MVD差异 对照组MVD值为10.34±2.83，CIN MVD值为34.71±4.01，SCC MVD值为59.88±7.65，组间比较差异显著(P&<0.05)。见图1。

　　图1 Ang2和CD34的表达(DAB，×100)

　　2.3 Ang2的表达与SCC临床病理特征的关系 Ang2在高分化癌组织中的阳性表达率44.3%，在中分化癌组织中为54.3%，在低分化癌组织中为81.2%，随着分化程度的降低，其阳性表达率明显升高，且三组之间相比差异有统计学意义(P&<0.05)。Ang2在有淋巴结转移组的阳性表达率为78.2%，在无淋巴结转移组的阳性表达率为49.5%，两者比较差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.4 SCC及CIN组织中MVD与Ang2的相关性分析 SCC及CIN组织中，MVD值与Ang2的表达强度呈显著正相关(r分别为0.61、0.52)。

　　3 讨 论

　　3.1 Ang2参与了SCC肿瘤血管的形成 近年来的研究表明Ang2与肿瘤本身的生长和侵袭转移及肿瘤性血管的生成密切相关，而肿瘤性血管是高度不成熟性血管〔1〕，其血管周细胞、平滑肌细胞较少，其形成一方面需要依赖于VEGF等促血管生成因子来刺激内皮细胞增殖和迁徙;另一方面需要克服保持血管稳定性因素。Ang2的表达是肿瘤性血管新生起始的强化因素，可能参与血管形成的早期启动阶段和激发阶段，通过拮抗Ang1稳定血管的作用，离断血管外周细胞与内皮细胞的相互作用，引起血管不稳定，使其更易接受其他促血管生成因子的刺激，在后者的共同作用下，引起肿瘤的血管生成，从而促进肿瘤的生长。大量实验表明Ang2在多种肿瘤组织中表达较正常组织中高，如：胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌等，而且Ang2的高表达与肿瘤MVD增高和肿瘤血管的不成熟性有关〔2〕，也有研究表明与肿瘤的侵袭性和患者愈后有关〔3〕。本研究发现Ang2的表达在SCC组织中最高，CIN次之，在对照组中低表达，提示Ang2参与了SCC肿瘤血管的形成，并在SCC的发生、发展过程中起到重要作用。

　　3.2 Ang2在SCC中的表达强度与临床生物学行为的关系 人体任何组织的生存、生长都需要血管供应充足的营养物质。而在肿瘤，特别是恶性肿瘤由于其新生和增殖比正常细胞快，故需要更多的血管供给其营养物质，因此肿瘤发生后的发展、转移与血管的生成密切相关。本研究发现在宫颈癌组织中，随着分化程度的降低，Ang2的阳性细胞率明显升高，三组之间相比差异有统计学意义(P&<0.05)。在有淋巴结转移组Ang2的阳性细胞率较无淋巴结转移组明显升高，两者比较差异有显著性意义(P&<0.05)。以上结果表明Ang2在宫颈癌的发生、发展及浸润、转移等恶性生物学行为中均有举足轻重的作用。此结论与众多学者得出结论一致，并在各种多血管性的肿瘤中得到了证实，比如恶性胶质瘤、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、神经母细胞瘤和甲状腺癌等。目前认为，Ang2与肿瘤血管的生长、侵袭能力关系更密切。Moon等〔4〕研究表明人肝细胞癌中在富血管组Ang2表达显著增加，在缺血管组Ang2表达较低，而Ang1的表达无显著变化。Ahmad等〔5〕将Ang1、Ang2转染HT29结肠癌细胞并种植到裸鼠身上，评价肿瘤的生长行为，结果Ang1、Ang2在肿瘤中表达都增高;Ang2转染小鼠肿瘤体积最大、血管计数和扩增指数也最高;而Angl转染组上述指标均最小。Etoh等〔6〕应用Northern杂交研究表明：Ang2表达量与胃癌肿瘤血管的数量和肿瘤的进展阶段呈正相关，Ang2表达水平高的，肿瘤恶性程度就高，同时患者存活时间也短。汪宏波等〔7〕关于卵巢上皮癌血管形成的研究中表明，随着卵巢癌的进展，肿瘤血管生成增多，复发性卵巢上皮性癌中MVD均高于未复发者。

　　3.3 宫颈癌中Ang2和MVD之间的关系 肿瘤的生长、侵袭和转移与肿瘤性血管的生成密切相关，肿瘤本身或肿瘤周边宿主组织建立的新生血管网供给肿瘤生长所必需的营养，促使肿瘤生长、侵袭和转移。肿瘤性血管的形成是一些促血管生成因子的作用结果，肿瘤本身或肿瘤周围局部微环境的改变，可导致促肿瘤血管生成因子的表达增加，在这些血管生成因子的作用下，使血管稳定的因素破坏，离断血管的周细胞和破坏正常血管形成的微环境，刺激血管内皮细胞迁徙和增殖，从而导致肿瘤性血管的生成。而新生血管一旦出现，肿瘤生长则加速，并易发生浸润和转移〔1〕。

　　本研究显示：经Spearman等级相关分析，SCC及CIN组织中，MVD值与Ang2的表达强度呈显著正相关，由此得出结论，在SCC及CIN中Ang2的阳性表达与MVD值之间存在正相关，随着Ang2表达的增加，MVD表达也相应增加。这一结果提示，Ang2可能促进宫颈癌中新生血管的形成，与宫颈癌的生长、侵蚀、转移相关。在以往的研究中，几乎全部文献在不同组织类型的恶性或良性肿瘤中都发现Ang2与MVD存在相关性。随着MVD的增高，Ang2的表达也相应增高。Li〔8〕和Wada〔9〕在肝癌中的研究发现Ang2的表达与MVD呈正相关。沈培强等〔10〕发现在结直肠腺癌中Ang2的表达与MVD相关，推论Ang2在结直肠腺癌的过度表达对血管新生起重要作用。彭林等〔11〕观察了Ang2基因转染人肝细胞癌细胞系SMMC7721后的体外成瘤性和血管生成的影响，发现表达Ang2基因后肿瘤组织中血管生成的数量较未转染前明显增多，从而得出结论：Ang2可能参与了肝细胞癌新生血管的形成过程。

　　综上所述，Ang2有望作为宫颈癌临床诊断及预后判断的指标之一，同时抗Ang2的治疗也有望成为宫颈癌抗肿瘤血管治疗的新方法。

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