重组蛋白酶抑制剂对大鼠胰腺缺血再灌注损伤的保护作用

　　　　 作者：孙波 黄秀英 张赢予 张馨木 孙任任

【摘要】 目的 探讨重组蛋白酶抑制剂(recombinant proteinase inhibitor，RPI)对大鼠胰腺缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法 Wistar大鼠30只随机分为假手术组、I/R模型组和RPI组，分别测定各组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量。检测各组血清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β) 的变化。结果 RPI组的淀粉酶、脂肪酶含量较模型组显著降低(P&<0.01);RPI组可明显降低模型组大鼠血清TNFα、IL1β(P&<0.01) 的水平。结论 RPI可以抑制大鼠胰腺I/R损伤所致的急性炎性反应，对大鼠胰腺I/R损伤有保护作用。

【关键词】 胰腺;缺血再灌注;重组蛋白酶抑制剂;淀粉酶;肿瘤坏死因子α

　 胰腺移植能增加患者胰岛素分泌细胞，从而有效地控制血糖，防止和改善糖尿病的并发症。早期胰腺炎是胰腺移植术后的常见并发症，而缺血再灌注(I/R)损伤是引起移植胰腺炎的主要原因，因此术后使用高效治疗胰腺炎的药物可取得较好的效果。重组蛋白酶抑制剂(RPI)是含有Kunitz结构域(Kunitz domain)的一个片段(289～345)，由57个氨基酸残基组成多肽，具有Kunitz型丝氨酸蛋白水解酶抑制(KPI)活性，能够有效地抑制胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、胰血管舒缓素等蛋白水解酶的活性。研究表明，成功地利用DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型RPI优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统〔1〕，并通过药效学实验证实RPI对急性胰腺炎有明显的治疗作用〔2〕。本研究旨在观察RPI在胰腺I/R损伤的保护作用，为临床防治胰腺I/R损伤提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物、试剂及仪器 Wistar大鼠30只，雌雄兼用，由吉林大学医学动物研究中心提供。RPI由吉林大学药学院制备。淀粉酶和脂肪酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。COLE PARMERP酶标仪 (新加坡 ) TJ6低温高速离心机(美国BACPKMA公司);2700型生化分析仪(日本SANYO公司);KUBOT KR2000T高速离心机(日本)。

　　1.2 动物模型与分组 术前实验动物禁食 12 h，自由进水，随机分为假手术组、I/R模型组和RPI组。术前30 min假手术组、I/R模型组尾静脉推注生理盐水1 ml，RPI组尾静脉推注RPI(8×104 kIU/kg) 。3%戊巴比妥钠 30 mg/kg腹腔注射，腹正中切口，分离胃脾韧带，结扎脾门血管，夹持脾脏，将胃翻向大鼠右侧，暴露膈肌与左肾动脉之间的腹主动脉，游离腹腔干至脾动脉，用无创动脉夹闭脾动脉，造成胰腺体尾缺血模型，30 min后松开动脉夹进行再灌注，松开动脉夹前各组按上述方法再次给药 1 次。假手术组以相同的手术方法切开显露腹腔干及脾动脉，但不夹闭血管。再灌注时间均为 6 h。

　　1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)测定 各组动物分别在再灌注后 6 h腹主动脉取血约 3 ml，2 000 r/min 离心 10 min，分离血清，测定血清AMY、Lipase。

　　1.4 大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(白介素1β)的测定 标本采集同1.3，分离血清，采用ELISA方法测定血清TNFα、IL1β，具体步骤按试剂盒要求进行。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，实验数据以x±s表示，各组数据的均数比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清AMY和Lipase的影响 I/R模型组大鼠血清AMY及Lipase含量均明显增高，与假手术组比较具有显著性差异。RPI组与I/R模型组比较，大鼠血清AMY及Lipase含量均明显降低(P&<0.01)。见表1。

　　2.2 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清TNFα和IL1β的影响 I/R模型组大鼠血清TNFα和IL1β水平均明显增高，与假手术组比较差异显著(P&<0.001)。RPI组与I/R模型组比较，大鼠血清TNFα和IL1β水平均明显降低(P&<0.01)。见表2。表1 RPI对胰腺缺血再灌注损伤大鼠血清淀粉酶和脂肪酶的影响(x±s，n=10，U/L)表2 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清TNFα和IL1β的影响(x±s，n=10，pg/ml)

　　3 讨 论

　　I/R损伤是造成胰腺移植后各种并发症的主要原因之一，如移植术后早期胰腺炎、移植术后胰岛细胞功能不良，这些都大大降低了胰腺移植的效果〔3〕。I/R损伤的具体发病机制复杂，目前认为与能量代谢障碍、 氧自由基的产生以及中性粒细胞激活并释放炎性细胞因子等有关〔4〕。

　　基因工程制备的RPI是一种小分子量β淀粉样蛋白前体(APP)，包含一段KPI结构域，具有强抑制活性，氨基酸序列与KPI家族的抑肽酶43%同源性，具有与KPI相同的生物学活性和药理作用。本研究中通过建立大鼠胰腺I/R损伤模型后，血清AMY和Lipase明显升高，而给予RPI治疗后则明显降低，说明RPI可有效地抑制胰酶的分泌和释放。

　　另外炎性细胞因子的释放在胰腺I/R损伤的病理生理中起重要作用。炎性细胞因子主要由机体的免疫细胞分泌，在各种因素刺激如感染、 外伤、 缺血后其表达可急剧增加，过度表达可导致或加重组织损伤〔5〕。其中，TNFα 和 IL1β 已被普遍认为是介导胰腺I/R损伤的主要细胞因子，其水平异常增高时，可直接作用于细胞，使组织细胞溶解;作用于中性粒细胞时，刺激中性粒脱颗粒，生成自由基，释放各种蛋白酶和其他水解酶，诱导细胞凋亡，造成局部组织损伤和毛细血管通透性增高，进一步加重微循环障碍，微循环障碍反过来又诱发炎症介质的释放。本研究也显示，RPI可明显降低I/R模型组血清TNFα、 IL1β，说明胰腺I/R后，RPI通过抑制炎性细胞因子的作用而达到对胰腺I/R的保护作用。

参考文献

　　1 贺巾超，杨莉莉，马 杰，等. KPI/AβPP大规模发酵及纯化工艺〔J〕.吉林大学学报：医学报，2006;32(2):21881.

　　2 颜波群. rhKD/APP对实验性大鼠急性坏死性胰腺炎的作用〔A〕.吉林大学博士论文，2006.

　　3 曹 鋆，芮 景.胰腺移植研究进展〔J〕.临床和实验医学杂志，2008;7(3)：16870.

　　4 吴其夏，余应年，卢 建.新编病理生理学〔M〕.北京：中国协和医科大学出版社，1999：191209.

　　5 Hanada T，Yoshimura A.Regulation of cytokine signaling and inflammation〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2002;13(45):41321.