丝胶对糖尿病肾病大鼠肾功能和肾脏TIMP1表达的影响

　　　　　　 作者：宋成军 郝祥俊 陈志宏

【摘要】 目的 观察彩色蚕茧提取物丝胶对糖尿病肾病(DN)大鼠肾功能和金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)表达的影响。方法 60只雄性SD大鼠随机分为5组(每组12只)：正常对照组、DN模型组、丝胶治疗组、二甲双胍组和丝胶预防组。除正常对照组外，其他各组大鼠均采用链脲佐菌素(STZ)制糖尿病动物模型成功后，丝胶治疗组大鼠给予丝胶灌胃(2.4 g·kg-1·d-1，35 d)、二甲双胍组大鼠给予二甲双胍灌胃(55.33 mg·kg-1·d-1，35 d)，丝胶预防组大鼠于注射STZ前给予同等剂量丝胶灌胃35 d。分别检测各组大鼠的血糖、肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量，免疫组化染色观察肾脏TIMP1蛋白的表达。结果 与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠的血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白含量和肾脏TIMP1蛋白的表达均明显升高(P&<0.01);丝胶治疗组、丝胶预防组和二甲双胍组大鼠的血糖、肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白含量和肾脏TIMP1蛋白的表达均明显低于模型组(P&<0.01，P&<0.05)，且丝胶治疗组、丝胶预防组与二甲双胍组比较无明显差别(P&>0.05)。结论 丝胶可明显改善DN大鼠的肾功能和降低肾脏TIMP1蛋白的表达，对DN时肾脏基质纤维化和肾小球结构破坏具有良好的保护和预防保护作用，且作用与二甲双胍相当。

【关键词】 丝胶;糖尿病;糖尿病肾病;肾功能;TIMP1

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of color silk cocoon extractionsericine on renal function and tissue inhibitors of tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) expression in kidney of diabetic nephropathy (DN) rats. Methods 60 male SD rats were randomly pided into 5 groups (n=12): normal， DN model， sericine treatment， metformin and sericine prevention groups. The rats in model， sericine treatment， metformin and sericine prevention groups were all established DN rats model by intraperitoneally injected streptozotocin (STZ). Blood glucose ≥16.7 mmol/L was taken to judge if the rats model were successfully established. After the rats model were successfully established: the rats in sericine treatment group were lavaged with sericine (2.4 g·kg-1·d-1， 35 d). The rats in metformin group were lavaged with metformin (55.33 mg·kg-1·d-1， 35 d). The rats in sericine prevention group were lavaged with the same dose sericine for 35 d before injecting STZ. The blood glucose， creatinine， urea nitrogen and 24 hours urine protein of rats in each group were respectively detected. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of TIMP1 in kidney. Results Compared with normal control rats， the blood glucose， creatinine， urea nitrogen， 24 hours urine protein and TIMP1 expression in kidney of model rats increased obviously (P&<0.01). The blood glucose， creatinine， urea nitrogen， 24 hours urine protein and TIMP1 expression in kidney of rats in sericin treatment group， sericin prevention group and metformin group were significantly lower than that of model group (P&<0.01， P&<0.05). Moreover， there was no obvious differences between sericin treatment group， sericin prevention group and metformin group (P&>0.05). Conclusions Sericin can obviously improve the renal function and decrease TIMP1 expression in kidney of DN rats， and has satisfactory protective and preventive effects on interstitial fibrosis and disorganization of kidney glomeruli. Moreover， the therapeutical and preventive effects of sericin on DN are similar with metformin’s.

　　【Key words】 Sericin; Diabetes mellitus; Diabetic nephropathy; Renal function; TIMP1

　 糖尿病肾病(DN)的发病机制目前尚未完全明了，一般认为是由高血糖或血脂代谢紊乱为启动因素所诱导的各种血管活性物质、生长因子、细胞介质等多种因素综合作用所致，造成肾脏肥大、细胞外基质(ECM)积聚、肾小球硬化、肾间质纤维化，最终发展为肾功能不全〔1〕。基质金属蛋白酶(MMPs)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是调节基质降解的重要因子，目前国内外学者普遍认为MMPs/TIMPs的失衡是导致ECM积聚、DN发生发展的重要机制〔2〕。本文观察了彩色蚕茧提取物——丝胶对DN大鼠肾功能和肾脏TIMP1表达的影响，以期找到充分改善糖尿病患者病情、提高糖尿病患者生活质量的新方法，本研究对蚕业产品的进一步开发也将起到推动作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物的选择及分组处理 清洁级雄性SD大鼠60只，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：712024。将大鼠随机分为5组，分别为正常对照组、DN模型组、丝胶治疗组、丝胶预防组和二甲双胍组，每组12只。模型组、丝胶治疗组、丝胶预防组和二甲双胍组大鼠均采用2%链脲佐菌素(STZ)(25 mg/kg，3 d)连续腹腔注射建立动物模型，以血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准。待模型成功建立后，模型组大鼠不再作任何处理;丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃，连续35 d;二甲双胍组大鼠给予二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃，时间同丝胶治疗组;丝胶预防组大鼠于注射STZ前给予同等剂量丝胶灌胃35 d。

　　1.2 药物与试剂 STZ购于美国Sigma公司，临用时用pH4.4的枸橼酸钠枸橼酸缓冲液配成2%的溶液。丝胶由彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成，彩色蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供。盐酸二甲双胍：辽宁一成药业有限公司提供，批号：国药准字h31024375，临用时研成细末用蒸馏水配成溶液。血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司(批号：20071030);尿素氮、肌酐检测试剂盒，北京首医临床科技中心(批号：20070705);尿蛋白EIA试剂盒，法国SPI公司(购自北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗TIMP1抗体，美国Santa公司;BCA蛋白定量试剂盒，购自北京泰格美科技有限公司。

　　1.3 定量检测24小时尿蛋白 各组大鼠分别于处死前1天用代谢笼收集24 h尿液，记录尿量，采用酶免分析法(EIA)测定24 h尿蛋白含量。

　　1.4 血液指标检测 各组大鼠禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦于眶后静脉丛采血，3 000 r/min离心20 min，收集血清，应用日本日立公司的Boehringer Mannhe in/Hitachi 717全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖、谷氨酸脱氢酶两点法检测尿素氮、酶法检测肌酐。

　　1.5 肾脏TIMP1蛋白表达的检测及定量分析 各组大鼠取血后断头处死，取肾脏入Bounin液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm。采用免疫组织化学染色方法检测肾脏TIMP1蛋白的表达。一抗为兔抗，稀释浓度为1∶100，DAB显色，苏木素复染细胞核。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用MiVnt图像分析系统对免疫组化阳性结果进行定量分析：TIMP1阳性切片在10×40倍显微镜下选取肾小球，计算阳性产物面积占肾小球面积的百分比。每只动物任选3张切片，每张切片选取3个肾小球，取平均值。

　　1.6 统计分析 实验数据以x±s表示，应用SPSS 11.5 统计学软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠血糖和24 h尿蛋白含量 与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠的血糖和24 h尿蛋白含量明显升高(P&<0.01)。丝胶治疗组、丝胶预防组和二甲双胍组大鼠的血糖和24 h尿蛋白含量明显低于模型组(P&<0.01)，且丝胶治疗组、丝胶预防组与二甲双胍组比较无明显差别(P&>0.05)，见表1。

　　2.2 各组大鼠血肌酐和尿素氮含量 模型组大鼠的血肌酐和尿素氮含量较正常对照组大鼠显著升高(P&<0.01)。丝胶治疗组、丝胶预防组和二甲双胍组大鼠的血肌酐和尿素氮含量明显低于模型大鼠(P&<0.01，P&<0.05)，且丝胶治疗组、丝胶预防组与二甲双胍组比较无明显差别(P&>0.05)，见表1。表1 各组大鼠的血糖、肾功能及肾脏TIMP1蛋白的表达(x±s，n=10)与正常对照组比较：1)P&<0.01;与模型组比较：2)P&<0.01，3)P&<0.05

　　图1 各组大鼠肾脏TIMP1蛋白的表达(DAB，×400)2.3 各组大鼠肾脏TIMP1蛋白的表达 TIMP1免疫阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状，位于细胞质，免疫阳性细胞为肾小球球内系膜细胞。与正常对照组大鼠相比，模型大鼠肾脏TIMP1蛋白的表达明显增高(P&<0.01)。丝胶治疗组、丝胶预防组和二甲双胍组大鼠肾脏TIMP1蛋白的表达明显低于模型大鼠(P&<0.01)，且丝胶治疗组、丝胶预防组与二甲双胍组比较无明显差别(P&>0.05)，见表1，图1。

　　3 讨 论

　　3.1 丝胶对DN大鼠肾功能的影响 检测蛋白尿是目前诊断DN的主要手段，而24 h尿蛋白定量又是诊断蛋白尿的金标准〔3〕;蛋白尿可改变肾小管上皮细胞的生物活性，尿中转铁蛋白等特殊的蛋白质亦可引起肾损害，导致肾功能严重下降〔4〕。DN时由于肾脏功能受损，肾小球滤过功能减低，肌酐和尿素氮的正常排泄受到阻碍，致使血液中肌酐和尿素氮含量增加。本研究发现，丝胶治疗组大鼠的血糖、24 h尿蛋白含量、血肌酐和尿素氮含量明显低于DN大鼠，表明丝胶可明显改善、保护DN大鼠的肾功能。本研究还发现，丝胶预处理可有效预防糖尿病时肾功能损害的发生，对DN的发生发展具有良好的预防作用。

　　3.2 丝胶对DN大鼠肾脏TIMP1表达的影响 MMPs是一组锌离子依赖性蛋白酶，其表达下调或者酶活性过度受抑，可引起ECM积聚，导致肾小球硬化〔5〕。TIMPs是肾内调节MMPs活性的主要物质，二者按1∶1比例结合形成MMPTIMP复合体，阻断MMPs与底物的结合和活化，参与调节ECM的代谢过程。已有研究证实〔6，7〕，DN时肾脏Ⅳ型胶原和TIMP1 mRNA的表达明显增强，导致MMPs活性降低，ECM降解减少、积聚增加，逐渐引起肾小球硬化和肾衰竭。因此，肾脏局部TIMP1活性增高可能是导致糖尿病大鼠肾脏系膜扩张、系膜基质增生、间质纤维化的主要原因之一。本研究发现，与DN大鼠相比，丝胶治疗组和丝胶预防组大鼠肾脏TIMP1表达明显降低，表明丝胶能够有效降低DN大鼠肾脏TIMP1表达，从而减弱其对MMPs的抑制作用，增加ECM降解，减轻ECM沉积和肾小球组织结构的破坏，达到治疗DN的作用。另外，丝胶预处理可以防止DN时肾脏TIMP1表达的增加，从而防止MMPs活性的降低和ECM的沉积，对DN时肾脏基质纤维化和肾小球结构破坏有良好的预防作用。

　　3.3 丝胶和二甲双胍对DN治疗作用的比较 二甲双胍作为传统降糖药物一直在临床广泛应用，但其所产生的副作用也不容忽视。其中，乳酸性酸中毒是二甲双胍最严重的不良反应，病人的死亡率较高〔8〕。蚕丝主要由丝素和丝胶两部分组成，以往的研究主要集中在丝素方面，约占茧丝30%的丝胶作为废料丢弃，浪费了大量的生物资源。本研究发现，丝胶对DN大鼠肾脏的保护作用与二甲双胍相当。但丝胶是天然蛋白质，具有生物相容性，可生物降解，对人体无毒性，避免了化学合成药物带给人体的副作用，因此具有良好的应用推广前景。

参考文献

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