吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用

　　　　 作者：张利众 赵瑞景3 刘建坤 高书涛 朱铁年

【摘要】 目的 探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)对2型糖尿病大鼠肝脏的保护作用及机制。方法 雄性Wistar大鼠，随机分为两组，正常对照组和高脂饮食组。喂养8 w后，高脂组腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，27 mg/kg)制造2型糖尿病大鼠模型，造模成功后随机分为两组：糖尿病模型组和PDTC治疗组。治疗1 w后断头处死大鼠，测定血脂，HE染色观察大鼠肝脏形态学变化，RTPCR检测iNOS mRNA 的表达。结果 糖尿病模型组较正常组血脂明显升高(P&<0.01)，PDTC治疗组与模型组相比无明显差别(P&>0.05);糖尿病模型组与正常组相比较肝脏明显脂肪变性，肝细胞损害，PDTC治疗组肝细胞脂肪变性及损害明显减轻。糖尿病模型组iNOS mRNA 的表达较正常组明显升高(P&<0.01)，经PDTC治疗后表达较糖尿病模型组降低(P&<0.01)。结论 PDTC可以减少iNOS mRNA 的表达，减少肝细胞脂肪变性及损伤。

【关键词】 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯;糖尿病;脂肪肝;诱生型一氧化氮合酶

　　【Abstract】 Objective To determine the protective effects of pyrrolidine dithiocarbamate on hepatic and its mechanism in diabetic rats.Methods Male Wistar rats were randomly pided into normalcontrol and highfat groups. After eight weeks of feeding， highfat group was given lowdose streptozotocin (STZ， 27 mg/kg ) intraperitoneal injection. After type 2 diabetes mellitus(T2DM) rat models were established， T2DM rats were randomly pided into diabetic model and diabeticPDTCtreated groups. After the rats were treated for a week， blood lipid levels were determined and livers were staining. The levels of iNOS mRNA were detected by RTPCR. Results Blood lipid level of diabetic model group was significantly higher than that of normalcontrol group(P&<0.01)， and no difference existed between diabeticPDTCtreated group and diabetic model group(P&>0.05). PDTC significantly reduced liver cell steatosis and damage compared with those of diabetic model group. The expression of iNOS mRNA was significantly higher in diabetic model group(P&<0.01)， and the expression in diabeticPDTCtreated group was significantly decreased than that of the diabetic model group(P&<0.01). Conclusions PDTC can reduce the expression of iNOS mRNA and liver steatosis and injury.

　　【Key words】 Pyrrolidine dithiocarbamate;Diabetes;Fatty liver;iNOS

　　 随着糖尿病患病率的增加，出现糖尿病并发症的患者逐年增多。对于糖尿病并发症人们关注最多的是血管及神经系统病变，而对于糖尿病合并肝脏病变研究较少，有研究表明糖尿病患者中合并肝脏病变高达50%以上〔1〕。本文从氧化损伤角度探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)对糖尿病肝脏病变的治疗作用及机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 链脲佐菌素(STZ)及PDTC，均购自美国Santa Cruz公司，PCR试剂盒购自Promega公司。清洁级雄性Wistar大鼠36只，体重180～210 g，购于河北医科大学动物中心〔许可证号(冀)20081003，批号：901010〕。高脂饲料参照Reed〔2〕报道的配方自行配制，其中普通饲料热量组成比值为：碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白质占24.2%。高脂饲料热量组成比值为：碳水化合物占39%，脂肪占42%，蛋白质占18%，其中脂肪主要为熟猪油和蛋黄粉。

　　1.2 方法

　　1.2.1 2型糖尿病(T2DM)模型的建立 参照Reed等〔2〕方法建立T2DM大鼠模型。所有大鼠适应性喂养普通饲料1 w后，随机分成两组，12只为正常对照组，喂普通饲料;24只为高脂饮食组，喂高脂饲料，喂养8 w后，给STZ 27 mg/kg一次性腹腔注射，共有23只大鼠成模，后随机分为两组，11只为T2DM模型组，12只为PDTC治疗组。PDTC治疗组给予PDTC腹腔注射治疗(50 mg/kg)，1次/d，连续治疗1 w，正常对照组、T2DM模型组给予同体积的生理盐水腹腔注射。治疗1 w后，过夜禁食12 h，PDTC治疗组处死前1 h给PDTC(50 mg/kg)腹腔注射治疗，其他组给生理盐水腹腔注射。断头处死，分别留取标本。

　　1.2.2 血液指标的测定 每组随机选取6只，处死时留取血液，分离血清，用自动化分析仪测定甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、游离脂肪酸(FFA)含量。

　　1.2.3 肝脏HE染色 在肝右叶取肝组织块，用10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡切片，HE染色，在光镜下观察肝脏形态学改变。

　　1.2.4 RTPCR 测定诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达水平 使用Trizol试剂抽提组织中的总RNA，测定浓度，逆转录为cDNA。根据GenBank中大鼠源iNOS，βactin全长设计引物。iNOS 5′ACCTGGGGAACACCTGGGGATTTT3′(正义链)， 5′GCTGGGTGGGAGGGGTAGTGATGT3′(反义链)。内参照βactin：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′ (正义链)， 5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′(反义链)。按照PCR反应试剂盒说明书，配制25 μl PCR反应液，反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，进行30个循环，最后72℃延伸5 min。取各目的基因扩增产物8 μl，经2%琼脂糖凝胶电泳，iNOS和βactin的PCR产物分别为218 bp和220 bp，紫外灯下观察并拍照。采用Image J 图像分析系统进行产物灰度图像分析，以iNOS与βactin的电泳条带光密度值的比值作为相对表达量。

　　1.3 统计学方法 实验数据以x±s表示，使用SPSS13.0统计软件，采用方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠生化指标检测 模型组大鼠TC、TG、LDLC、FFA水平均明显高于对照组，且差异显著(均P&<0.05)，经PDTC治疗后血TC、LDLC、FFA略有下降，但与模型组比较差异无统计学意义(均P&>0.05)，但是TG下降明显，且与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。见表1。

　　2.2 肝脏组织HE染色 正常组肝小叶结构清晰完整，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝细胞核结构清晰，肝细胞形态正常。肝窦正常，连接成网状。糖尿病模型组肝细胞肿大明显，胞浆染色不均，肝细胞内出现大量大小不一脂肪空泡，肝细胞边界不清，细胞排列紊乱，肝索结构消失，肝小叶结构模糊不清。PDTC治疗组肝细胞形态正常，胞核结构清晰，部分肝细胞浆内可见小脂滴形成，局部细胞界限不清。肝小叶结构尚清，肝细胞索排列整齐、呈放射状，肝窦正常，部分肝索排列紊乱，与糖尿病模型组比较肝脏脂肪变性及损伤减轻。见图1。表1 各组大鼠TC、TG、LDLC、FFA变化比较(x±s)

　　2.3 iNOS mRNA的表达 正常对照组可见亮度很弱的目的条带，糖尿病模型组可见明显清晰明亮的目的条带，与正常组比较，其表达的水平明显升高(P&<0.01);PDTC治疗组的目的条带量度较弱，与糖尿病模型组比较，其表达的水平下降(P&<0.01)。见图2。

　　图2 各组iNOS mRNA的表达

　　3 讨 论

　　糖尿病患者十分容易并发肝脏损害，其中最主要的病变为脂肪肝，但其具体机制不完全清楚，既往对糖尿病肝损害的原因主要认为是与糖尿病脂质代谢的紊乱有关，而很少注意到炎症、免疫因素在其发生中的重要作用，其中氧化损伤可能在病理过程中起重要作用。目前公认糖尿病是一种炎症，并发症可涉及全身多个系统和器官，其中包括肝脏的损伤。有研究表明，胰岛素抵抗、氧化应激、核因子(NF)κB活化和TNFα等炎性因子的产生与活化在脂肪肝的发生中起着十分关键的作用〔3〕。正常状态下NFκB与其抑制性蛋白(IκB)结合于细胞质中，处于失活状态。在高糖及高脂产生的各种炎性因子刺激下，诱导IκB 发生磷酸化使其与P50P65解离而使NFκB活化，活化的NFκB转位到细胞核内，使其下游基因iNOS表达上调，增加了NO的合成，进一步造成了DNA的损伤和细胞凋亡发生〔4〕。

　　一氧化氮合酶(NOS)是一氧化氮(NO) 生物合成的关键限速酶，包括结构型NOS(cNOS)和诱生型NOS(iNOS)，cNOS主要分布于内皮细胞和血小板等处，其生物效应以生理状态下细胞间信息传递为主。在肝脏中iNOS分布于肝细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞等，在病理状态下可被多种因素诱导活化，产生大量具有细胞毒性作用的内源性NO，参与各种肝病的病理过程〔5〕。急性肝损伤时，cNOS mRNA 无明显升高，而iNOS mRNA 的表达升高，由于iNOS 基因表达的增多介导肝脏NO生成，说明了在肝病发生中iNOS 具有的显著作用〔6〕。当肝脏细胞中NO的浓度远高于生理浓度时，可以与过氧化物阴离子反应生成羟基，通过抑制线粒体呼吸链;抑制肝细胞蛋白质合成;与DNA 结合使之亚硝酰化，致DNA 断裂或突变;引起组织细胞脂质过氧化;引起内质网的应激等机制造成肝细胞损伤〔7，8〕。

　　PDTC为二硫氨基酸酯，其分子所含巯基(thiol)结构，具有金属螯合作用，许多试验已经证实，PDTC 是NFκB的抑制剂，能够阻断NFκB激活的信号通路，抑制NFkB活化;并能阻止抑制性亚单位IκB的降解，同时也可以阻碍NFkB向细胞核内的转移，在转录水平上抑制MCP1、IL1、IL6、TNFα等炎性细胞因子的产生，可阻止细胞因子诱导炎症介质基因表达，因此具有抗炎作用〔9，10〕。

　　本研究发现，模型组大鼠血脂明显高于对照组，经PDTC治疗后血TC、LDLC、FFA略有下降，但与模型组比较无统计学意义。TG下降明显，与模型组比较有统计学意义。肝脏形态学显示：模型组大鼠肝细胞损伤并发生明显脂肪变性，同时模型组大鼠肝脏iNOS mRNA 表达明显增加，进一步证实肝脏损害与iNOS表达增加相关。经PDTC治疗后肝脏损伤明显减轻，同时PDTC治疗组iNOS mRNA表达减少。实验结果提示，PDTC对于肝脏损伤的保护作用并不完全是通过降低血脂来实现的。PDTC的治疗作用可能是通过阻断NFkB/iNOS信号通路，使iNOS mRNA 的表达下调，减少肝脏中活性氧的产生，而抑制肝脏炎症反应，而对脂肪性肝炎起治疗作用，为糖尿病脂肪肝的治疗提供新途径。

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