罗格列酮对CXCL16诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

【摘要】 目的 研究罗格列酮对CXCL16诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用。方法 利用MTT法观察CXCL16对离体培养血管平滑肌细胞增殖作用的影响以及罗格列酮对这一增殖的影响。结果 罗格列酮能抑制CXCL16诱导的血管平滑肌的增殖。结论 罗格列酮能够抑制CXCL16对血管平滑肌的增殖。

【关键词】 罗格列酮;CXC趋化因子配体16;血管平滑肌细胞

　 研究表明CXC趋化因子配体16(CXC chemokine ligand 16，CXCL16)作为一种新的趋化因子配体，能够促进动脉平滑肌的增殖〔1〕。罗格列酮(RSG)作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的激动剂抑制血管平滑肌细胞的增殖〔2〕。本研究通过观察RSG对CXCL16诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响，验证其在血管平滑肌增殖中的作用，并进一步探讨其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 成年大鼠，雌雄不限(由吉林大学实验动物中心提供)。RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，重组鼠CXCL16(美国R&&D systems公司)，LY294002(美国BioVision公司)，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)(美国Sigma公司)，兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(αSMA)多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)，兔抗大鼠CXCL16多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。RTPCR试剂盒(立陶宛MBI Fermentas公司)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠髂主动脉平滑肌细胞的分离与培养 经水合氯醛麻醉后，颈动脉放血处死动物。在无菌操作条件下迅速取出全部髂段主动脉，立即置于冷DHank′s液中，用眼科镊仔细剥离近外膜侧1/3处含成纤维细胞多的外膜后，放在无菌的玻璃纸上固定后，纵形剖开血管，用锋利刀片轻轻刮除多余脂肪及内膜，DHank′s液洗涤，放入培养皿中，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，将小组织块均匀铺于培养瓶壁，置于CO2孵箱。待组织块贴壁牢固后，再加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养。

　　1.2.2 平滑肌细胞的传代及鉴定 待细胞生长至瓶底的80%以上后，吸弃培养液，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗3次。加入0.25%胰蛋白酶少许，室温下将培养瓶置于倒置显微镜下观察。待细胞回缩、细胞间隙增大后，立即用含10%胎牛血清的培养液终止消化，吸除消化液，加PBS液，轻轻转动培养瓶，除去残余消化液。加入培养液，用吸管轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之脱落瓶壁形成细胞悬液，分装后继续培养。取其4～6代细胞用兔抗大鼠αSMA多克隆抗体对其进行鉴定。

　　1.2.3 用细胞计数法检测CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响 以1×104/ml个细胞接种于24孔培养板，用浓度为50 ng/ml的CXCL16分别作用于平滑肌细胞1、2、4及8 d，用细胞计数法测定平滑肌细胞的增殖情况。仅含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为阴性对照;含20 ng/ml血小板生长因子(PDGF)BB的上述培养液作为阳性对照。

　　1.2.4 药物处理 取1.2.2传代细胞，分为5组，用不同药物进行处理。空白对照组(1组)：RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)培养细胞。CXCL16组：在1组培养液基础上加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。PI3K/Akt特异性抑制剂组(CXCL16+LY294002)：在1组培养液基础上加入终浓度为20 μmol/L LY294002，作用1 h后，再加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。核转录因子(NFκB)特异性抑制剂组(CXCL16+PDTC)：在1组培养液基础上加入终浓度为100 μmol/L PDTC，作用1 h后，再加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。RSG组(CXCL16+RSG)：在1组培养液基础上加入终浓度为20 μmol/L RSG，作用1 h后，再加入终浓度为50 ng/ml CXCL16。每组至少重复3次。

　　1.2.5 噻唑蓝(MTT)法检测血管平滑肌细胞的增殖 将细胞消化后，制备单细胞悬液。以1×104个/孔接种至96孔板，培养24 h后弃去上清，加入条件培养基150 μl，每组设8个复孔。培养4 d后，吸弃培养液，每孔加入20 μl MTT，37℃继续孵育4 h。吸弃培养液，每孔加入150 μl DMSO终止反应。振荡混匀，置酶标仪上测定490 nm处的吸光度(A490)。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.5软件，所有数据以x±s表示。组间比较采用方差分析或秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 血管平滑肌细胞的鉴定 倒置显微镜下观察，细胞呈长梭形生长，在细胞生长融合部分可见明显的“峰谷”形态。用平滑肌细胞特异性抗体αSMA进行免疫细胞化学鉴定，光镜下观察可见细胞胞质内棕黄色颗粒，证明培养的细胞为血管平滑肌细胞。见图1。

　　图1 大鼠平滑肌细胞免疫组化鉴定(DAB，×400)

　　2.2 CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响 自CXCL16作用的第1天起，CXCL16组平滑肌细胞增殖能力明显高于阴性对照组(P&<0.05)，提示CXCL16可促进平滑肌细胞增殖。实验中还观察到，此促进作用在培养的第4天表现得最为明显，即增殖最高峰出现在第4天。因此，后续关于诱导平滑肌细胞增殖的MTT法选择CXCL16作用的第4天进行。见表1。表1 CXCL16对平滑肌细胞增殖的影响(×104/ml，x±s)与阴性对照组比较：1)P&<0.05，2)P&<0.01

　　2.3 RSG抑制平滑肌细胞的增殖 以50 ng/ml CXCL16作用于平滑肌细胞4 d后，采用MTT法测定细胞的增殖能力。结果显示，CXCL16组平滑肌细胞增殖能力较对照组明显提高(P&<0.01)，其余三组与CXCL16组比较明显降低(P&<0.05)，表明RSG可抑制CXCL16诱导的平滑肌细胞增殖。见表2。表2 RSG对CXCL16诱导的平滑肌细胞增殖的影响

　　3 讨 论

　　人们发现动脉粥样硬化(AS)不只是简单的脂质堆积，炎症在其发生、发展以及最终斑块破裂的整个病理过程中显示出至关重要的作用〔3〕。因此，许多细胞因子引起了人们的关注，CXCL16是一种新发现的趋化因子配体。已发现CXCL16可促进平滑肌细胞、内皮细胞增殖，还能增加细胞与细胞的黏附，也有研究发现AS斑块处巨噬细胞和平滑肌细胞CXCL16表达增高，因此可推断CXCL16在多个环节参与AS的发生、发展，同时也提示它可能在损伤修复以及炎症反应中起着重要的作用。本研究以离体血管平滑肌细胞为原料，发现CXCL16组平滑肌细胞增殖能力明显高于阴性对照组，这种促进作用的峰值出现在第4天，此结果验证了它对血管平滑肌细胞的增殖作用，同时也证实尽管炎症反应在上调CXCL16表达中起着重要的作用，但最终这些炎症反应引起的细胞增殖可能还是由CXCL16及其受体来实现的。这就为纠正CXCL16表达，进而治疗AS等损伤修复型疾病提供了一种新的可能。

　　RSG除了作为胰岛素的增效剂在临床上广泛应用外，近年也有很多用它治疗AS等其他疾病的尝试〔4～6〕。RSG可提高内皮系统对各种损伤的修复能力，也提示了胰岛素增敏剂对血管内皮细胞很好的保护作用，对维持血管内皮系统功能至关重要〔7〕。本研究通过MTT法验证RSG对CXCL16诱导的血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用。RSG等噻唑烷二酮类药物改善血管内皮功能、抗AS的机制尚未彻底清楚可能为：① 通过增加胰岛素的敏感性，增加eNOS的表达，促进内皮细胞释放NO，抑制ET1的释放等间接的因素而改善内皮功能〔8〕;②最近发现PPARγ也存在于AS发展的关键细胞如血管平滑肌细胞、巨噬泡沫细胞和血管内皮细胞，提示噻唑烷二酮类药物可直接作用于PPARγ影响AS的进程〔9〕;③ 抑制炎性介质释放，发挥抗炎、抗氧化应激作用，减轻AS发展过程〔10〕。同时，发挥降糖、降脂作用，调节血管内皮功能，从改善代谢方面发挥保护作用。本实验为RSG抗血管平滑肌增殖提供依据，同时也为开发罗格列酮临床上新的使用途径提供了理论基础，噻唑烷二酮类药物抗AS的具体机制还需更进一步研究。

参考文献

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